21.3.21

VIROLOGIA 2: REPLICAÇÃO VIRAL

REPLICAÇÃO VIRAL

Morfologia dos Bacteriófagos

Bacteriófagos, também chamados de fagos, são vírus que infectam organismos procariotos, sendo considerados as entidades biológicas mais abundantes do planeta Terra.

Estima-se a existência de 10 elevado na 32, bacteriófagos no planeta, estando presente em todos os meios onde existir o hospedeiro (Furfaro; Chang; Payne, 2018; Kutter; Sulakvelidze, 2005; O´Flaherty; Ross; Coffey, 2009; Wittebole; De Roock; Opal, 2014, Röhnelt, 2020).


Estrutura de um fago T4

Alguns tipos morfológicos de bacteriófagos

A descoberta dos fagos foi atribuída a Felix d’Herelle, em 1917, que trabalhava no Instituto Pasteur, em Paris. O achado se deu pela observação de filtrados de esgoto, onde ele identificou um agente capaz de eliminar as bactérias de uma cultura de disinteria (Shigella), atribuindo ao final, a natureza viral desse agente.

A atividade do fago também foi anteriormente descrita por Hankin, em 1896, que detectou propriedades contra a bactéria da cólera, constatando a habilidade de passar por filtros bacteriológicos (filtros de Chamberland); contudo, essa descoberta não foi remetida a um agente viral.

Outro bacteriologista que participou independentemente da descoberta foi Twort, em 1915, que encontrou um agente capaz de lisar bactérias em culturas. Seu trabalho foi publicado, porém as pesquisas não foram continuadas devido ao começo da Primeira Guerra Mundial (Ackermann, 2003; Brüssow, 2013; O'Flaherty; Ross; Coffey, 2009; Orlova, 2012). Um avanço importante na área foi a criação do Instituto George Eliava de Bacteriófagos, Microbiologia e Virologia, aberto em 1923 em Tbilisi, Georgia, onde foram realizadas diversas pesquisas com fagos (O’Flaherty; Ross; Coffey, 2009; Orlova, 2012). Um breve histórico dos fagos, desde sua descoberta até sua utilização em alimentos, é demonstrado na Figura a seguir.
Linha do tempo do estudo e uso dos fagos (phage) ou bacteriófagos
Fonte: O’Flaherty; Ross; Coffey, 2009, em Röhnelt, 2020.

Os bacteriófagos possuem hospedeiros específicos, ou seja, apenas infectam bactérias que possuem receptores próprios para a ligação das proteínas virais fágicas. A inexistência de tal receptor torna o fago incapaz de se ligar a bactéria alvo e liberar o seu material genético na célula (Dowah; Clockie, 2018; Silva; Storms; Sauvageau, 2016). A principal ordem dos bacteriófagos é Caudovirales, que apresenta cinco famílias: Siphoviridae, Myoviridae, Podoviridae, Herelleviridae e Ackermannviridae, as quais são caracterizadas por apresentarem genoma de DNA fita dupla (ICTV, 2020).

Os fagos são classificados de acordo com seu hospedeiro, características morfológicas, tipo de ciclo viral, genoma, local onde habitam e estruturas (como cauda e envelope) (Wittebole; De Roock; Opal, 2014). Caudovirales possuem forma icosaédrica e são diferenciados morfologicamente pelo tipo de cauda que apresentam, podendo ser longa e flexível, longa e retrátil ou curta. Essa cauda é responsável por transmitir sinais para o fago, assim como pela adsorção e injeção do material genético na célula hospedeira (O’Flaherty; Ross; Coffey, 2009; Orlova, 2012). Além do formato icosaédrico, os fagos podem apresentar formato filamentoso, poliédrico ou pleomórfico, além de conter envelope viral (Ackermann, 2003; Wittebole; De Roock; Opal, 2014, Röhnelt, 2020).

Morfologia dos bacteriófagos





Bacteriófagos, ou mais coloquialmente fagos, são vírus que possuem a capacidade de infectar e se replicar com células bacterianas. Eles são montados a partir de dois tipos principais de biomoléculas, os ácidos nucléicos e as proteínas, com a última formando um capsídeo e a primeira sendo encapsulada. Nos hospedeiros eucarióticos, os fagos são antígenos particulados inertes e não podem desencadear a patogênese. Nos últimos anos, muitos estudos têm explorado o uso de fagos como plataformas de nanomedicina para o desenvolvimento de vacinas devido às suas características biológicas únicas. As partículas de fago inteiras podem ser usadas para projeto de vacina na forma de vacinas exibidas em fago ou vacinas de DNA de fago. As vacinas exibidas por fagos são os fagos com antígenos peptídicos ou proteicos geneticamente exibidos em suas superfícies (capsideio ou envelope), bem como aqueles com antígenos quimicamente conjugados ou biologicamente ligados em suas superfícies. Os fagos podem então entregar os peptídeos imunogênicos ou proteínas às células ou tecidos alvo. As vacinas de DNA de fago são os genes de vacina dirigidos por promotores eucarióticos inseridos nos genomas do fago, que são transportados pelos fagos para as células-alvo para gerar antígenos. Os antígenos, como os peptídeos imunogênicos ou proteínas exibidos nos fagos, ou como os produtos expressos dos genes da vacina, podem servir como vacinas para induzir respostas imunes para a prevenção e tratamento de doenças. Tanto as vacinas exibidas por fago (proteínas) quanto as vacinas de DNA de fago (fago portador do gene que produz o antígeno) prometem um futuro brilhante para o desenvolvimento de vacinas. (Bao, Li, Han, Zhu, Mao e Yang, 2019).

Micrografias SEM de células de Escherichia coli que foram expostas ao bacteriófago. a) Foram observadas células aumentadas (células A e B) e a ruptura da parede celular é indicada pela seta C. A seta D mostra uma protuberância suspeita de ser um bacteriófago. b) Uma célula de E. coli aumentada como em A que foi submetida a ataque de argônio no NanoSAM. As setas A e B mostram protuberâncias que são suspeitas de serem bacteriófagos dentro da célula, que foram expostas através do processo de ataque "etching"(Bragg et alii, 2016).

(SEM micrographs of  cells which have been exposed to bacteriophage. a Enlarged cells were observed (cells A and B) and cell wall tearing is indicated by arrow C. Arrow D shows a protuberance suspected to be a bacteriophage. b An enlarged E. coli cell as in A which was subjected to Argon etching in the NanoSAM. Arrows A and B show protuberances that are suspected bacteriophages inside the cell, which have been exposed through the etching process.) (Bragg et alii, 2016)
 



a) Partícula de fago normal com cauda estendida e fibras dobradas. b) Partícula fágica com cauda contraída aderindo a pequenas vesículas globulares. Observe que as fibras da cauda não são mais visíveis. c) Partícula de fago normal com cauda estendida e fibras flexíveis com pequenas estruturas globulares terminais anexadas. d) Partícula fágica com cauda contraída. Observe que as fibras da cauda ainda são visíveis. Os fagos foram corados com acetato de uranila a 2% e examinados em microscópio eletrônico de transmissão Tecnai 10. (plosone).

(a. Normal phage particle with extended tail and folded-up fibers. b. Phage particle with contracted tail sticking in small globular vesicles. Note the tail fibers are no longer visible. c. Normal phage particle with extended tail and flexible fibers with attached small terminal globular structures. d. Phage particle with contracted tail. Note tail fibers are still visible. Phages were stained with 2% uranyl acetate and examined on a Tecnai 10 transmission electron microscope.)



DNA de um fago T




Os bacteriófagos, descobertos há cerca de um século, têm sido fundamentais como modelos para a compreensão dos princípios fundamentais da biologia molecular. Embora o interesse na biologia dos fagos tenha diminuído após a “era de ouro dos fagos”, os principais desenvolvimentos recentes, incluindo avanços na genômica dos fagos, microscopia e a descoberta do sistema de defesa antifago CRISPR-Cas, desencadearam um renascimento na pesquisa de fagos na década passada (Ofir and Sorek, 2018).

(Bacteriophages, discovered about a century ago, have been pivotal as models for understanding the fundamental principles of molecular biology. While interest in phage biology declined after the phage “golden era,” key recent developments, including advances in phage genomics, microscopy, and the discovery of the CRISPR-Cas anti-phage defense system, have sparked a renaissance in phage research in the past decade.(Ofir and Sorek, 2018).)

O ciclo lítico e o ciclo lisogênico

Replicação viral de um fago no citoplasma de uma bactéria

A replicação viral ocorre, essencialmente, em duas formas principais, ciclo lisogênico e ciclo lítico (Figura acima). Independentemente do tipo de ciclo, o primeiro passo para a infecção do hospedeiro é a adsorção viral, onde ocorre a ligação à superfície da bactéria, através de proteínas localizadas nas fibras da cauda que se unem aos receptores específicos presentes na camada externa da bactéria. Após a ligação irreversível aos receptores, começa o processo de injeção do material genético, onde por fim, o fago induz a formação de um poro na membrana celular com ajuda de enzimas, através do qual o material genético é introduzido. Esse processo ocorre de formas distintas de acordo com o tipo de cauda presente no fago.

1) Adsorção: O fago se liga aos receptores de adesão das células-alvo por meio de suas fibras da cauda
A exolisina viral degrada a parede celular do hospedeiro localmente
2) Ejeção do DNA viral no citoplasma da célula hospedeira por sistema de ejeção de cauda longa e flexível
3) Transcrição e tradução dos primeiros genes
4) Replicação do DNA genômico
5) Transcrição e tradução de genes tardios
6) Montagem de um procapsídeo vazio e embalagem do genoma.
7) Montagem de fibra da cauda viral e montagem da cauda viral.
8) Lise e liberação: Os vírions maduros são liberados da célula por lise.

Adsorção/Ligação (attatchment)
A adsorção do bacteriófago é o primeiro passo para iniciar o processo de infecção. As proteínas de ligação do bacteriófago localizadas principalmente nas fibras da cauda interagem e reconhecem receptores específicos presentes na parede celular bacteriana. A ligação do fago à célula hospedeira resulta em alterações morfológicas tanto no fago quanto na bactéria, facilitando a penetração do fago em uma bactéria hospedeira.

Penetração
A lisozima como a enzima encontrada nas caudas do fago enfraquece a parede celular bacteriana. A bainha da cauda se contrai, o tubo oco (core) penetra na parede celular enfraquecida e entra em contato com a membrana plasmática. 
O DNA viral se move da cabeça através do tubo para o citoplasma bacteriano enquanto o capsídeo do fago permanece fora.

Replicação
Os genes de fago assumem o controle da maquinaria metabólica da célula hospedeira e direciona a célula hospedeira para produzir apenas produtos virais. O DNA bacteriano é fragmentado e seus nucleotídeos são usados ​​como blocos de construção para o DNA de novos fagos.
O DNA do fago é transcrito em mRNA usando a maquinaria da célula hospedeira. A tradução de mRNA e proteínas do capsídeo e enzimas virais são produzidas.

Montagem 
A cabeça do fago T4 é montada no citoplasma das células hospedeiras a partir de proteínas do capsídeo recém-sintetizadas. Uma molécula de dsDNA viral é embalada em cada cabeça viral. 
As caudas de fago são montadas a partir de placas da base, bainhas e colares recém-formados. Quando a cabeça está devidamente embalada com DNA, cada cabeça é ligada a uma cauda. As fibras da cauda são adicionadas e fagos infectantes maduros totalmente formados se desenvolvem.

Lise e liberação
A lisozima quebra a parede celular bacteriana e as células bacterianas hospedeiras são lisadas. O fago liberado infecta outras bactérias suscetíveis e o novo processo de infecção é iniciado.



Ciclo lisogênico

Logo após o material genético ser injetado, o ciclo de replicação se inicia. No caso do ciclo lisogênico (fagos temperados), o DNA viral se integra ao DNA bacteriano ou, em alguns casos, se mantém na forma de plasmídeo. A partir desse momento, o fago apresenta a forma latente, sendo sintetizadas apenas proteínas de repressão, que inibem a transcrição de outros genes, além de proteínas ligadas a imunidade da bactéria às novas infecções (Röhnelt, 2020). Quando o DNA do fago está incluso no DNA da bactéria ele é chamado de profago ou prófago e pode ser transmitido por diversas gerações de bactérias sem maiores consequências (Orlova, 2012). Os fagos que utilizam esse tipo de ciclo são caracterizados por possuírem genes que codificam a proteína integrase (INT), enzima mediadora da recombinação entre o DNA do fago e o do hospedeiro (Groth, 2004 e Calos, 2004).

A exposição a algum tipo de estresse pode acarretar a alteração do tipo de clico realizado, ou seja, o fago lisogênico passa para o ciclo lítico. Entre as ações que alteram o ciclo estão as mudanças no ambiente, como a falta de nutrientes, exposição aos raios ultravioleta, uso de antibióticos e de outros agentes químicos (Röhnelt, 2020).


Ciclo lítico

Por outro lado, no ciclo lítico, após a introdução do material genético na bactéria, a maquinaria celular do hospedeiro é sequestrada e direcionada para a produção dos componentes fágicos, como nucleotídeos e proteínas virais (Röhnelt, 2020). Por fim, ocorre a montagem de novos virions e a produção de enzimas responsáveis pela degradação da parede celular bacteriana, permitindo a liberação dos fagos no meio externo mediante a morte (lise) do hospedeiro.

Assim como as bactérias, os bacteriófagos também podem se adaptar, escapando das barreiras criadas pela célula, culminando na replicação dentro do hospedeiro. O conhecimento desses mecanismos é importante para o entendimento completo dos bacteriófagos, pois contribui para avaliação de sua utilidade. Entre as ferramentas utilizadas pelos fagos para driblar a imunidade da bactéria está a habilidade de se adaptar aos novos receptores criados pelas bactérias, assim como reconhecer a camada extracelular criada pelas mesmas, tendo a capacidade de se ligar ou degradar até alcançar o receptor na célula (Röhnelt, 2020). Outro exemplo é o sistema de anti-restrição presente no fago T4 que contém uma base incomum, a hidroximetilcitosina (HMC), ou seja, o sistema de restrição-modificação não reconhece o DNA invasor, permitindo a progressão normal do vírus na célula (Calendar, 2006; Labrie; Samson; Moineau, 2010). Os diversos mecanismos de evasão da resposta imune das bactérias permitem que os fagos continuem se disseminando, evoluindo de maneira conjunta aos seus hospedeiros (Matsuzaki et al., 2005).

Ciclo de vida de um fago. Fases do ciclo de vida de um fago que podem ser alvo de diferentes mecanismos anti-fagos.
(Stages of a Phage’s life cycle that can be targeted by different anti-phage mechanisms)

(A) Ciclo de vida do fago; (B) Taxonomia de fagos baseada na morfologia e composição do genoma. Um "fago tipo" representativo para cada grupo taxonômico está entre parênteses.
(A) Phage life cycle; (B) Phage taxonomy based on morphology and genome composition. A representative type phage for each taxonomical group is in parenthesis.

Decisão entre ciclo lítico e lisogênico em fagos 

(A) Quando múltiplos bacteriófagos lambda (fago λ) infectam um único hospedeiro, uma célula de Escherichia coli, um “voto” unânime para a lisogenia por todos os fagos infectantes é necessário para o eventual estabelecimento da lisogenia (Zeng et al., 2010).

(B) Decisões de lisogenia baseadas na comunicação. Quando o fago phi3T (φ3T) infecta seu hospedeiro Bacillus, ele libera uma quantidade medida de um peptídeo de 6 aa chamado arbitrium (pontos azuis). Após vários ciclos de infecção, as concentrações crescentes do peptídeo de arbitrium levarão o fago à lisogenia (Erez et al., 2017).

(C) Em vários micobacteriófagos, o local de integração lisogênica (attP) é encontrado dentro do gene repressor (rep). Antes da integração ao genoma, o repressor contém uma "etiqueta" C-terminal (verde) que o leva à degradação, promovendo assim a lise. Após a integração, a etiqueta é separada e o repressor torna-se estável, permitindo a manutenção da lisogenia (Broussard et al., 2013).

(D) Profagos como interruptores genéticos em bactérias. A integração do fago no genoma bacteriano interrompe um gene, tornando-o inativo. Quando o gene é necessário, o genoma do fago é excisado, reconstituindo o gene funcional.

(A) When multiple lambda phages infect a single E. coli host, a unanimous “vote” for lysogeny by all infecting phages is necessary for eventual establishment of lysogeny (Zeng et al.,2010).
(B) Communication-based lysogeny decisions. When phage phi3T infects its Bacillus sp host, it releases a measured amount of a 6 aa peptide called arbitrium (blue dots). After several cycles of infection, the rising concentrations of the arbitrium peptide will lead the phage to lysogeny (Erez et alii, 2017).
(C) In several mycobacteriphagos, the site of lysogenic integration (attP) is found within the represssor (rep) gene. Prior to genome integration, the repressor contains a C-terminal tag (green) leading it to degradation, thus promoting lysis. Following integration, the tag is separated, and the repressor becomes stable, allowing lysogeny maintenance (Broussard et al., 2013).
(D) Prophages as genetic switches in bacteria. Phage integration into the bacterial genome disrupts a gene, turning it inactive. When the gene is needed, the phage genome is excised, reconstituting the functional gene.

Microscopia de alta resolução revela novas estruturas dinâmicas em fagos

(A) Uma concha semelhante a um núcleo que abrange o centro de replicação do fago 201ϕ2-1 durante a infecção de seu hospedeiro Pseudomonas chlororaphis (Chaikeeratisak et al., 2017). Os filamentos semelhantes à tubulina formam um fuso que posiciona a "concha" dentro da célula bacteriana (Erb et al., 2014). A maquinaria de replicação do fago e o DNA de replicação estão contidos nessa concha. Os capsídeos dos fagos são montados fora dessa "concha" e migram para sua superfície para serem embalados com DNA. A "concha" mostrou girar constantemente, mas a função dessa rotação é desconhecida (Chaikeeratisak et al., 2017). 

(B) Reconstrução estrutural crio-EM de vírions T7 durante a adsorção e infecção (injeção do DNA). Antes da adsorção, a maioria das fibras da cauda são dobradas sobre o vírion e se estendem apenas após a fixação à célula. O centro interno é então ejetado e atravessa a membrana dupla. De Hu et al. (2013). Reproduzido com permissão da AAAS.

(C) Estrutura crio-EM da placa basal do fago T4 antes e depois da adsorção. A placa de base sofre extensas mudanças estruturais e as fibras da cauda curta são estendidas para permitir a adsorção irreversível. Reproduzido com permissão de Macmillan Publishers: Nature (Taylor et al., 2016), copyright 2016.

High-Resolution Microscopy Reveals New Dynamic Structures in Phages.
(A) A nucleus-like shell encompassing the replication center of phage 201ϕ2-1 during infection of its host Pseudomonas chlororaphis (Chaikeeratisak et al., 2017). Tubulin-like filaments form a spindle that positions the shell inside the bacterial cell (Erb et al., 2014). The phage replication machinery and the replicating DNA are contained within the shell. Phage capsids are assembled outside of the shell and migrate to its surface to be packed with DNA. The shell was shown to constantly rotate, but the function of this rotation is unknown (Chaikeeratisak et al., 2017). 
(B) Cryo-EM structural reconstruction of T7 virions during adsorption and DNA infection. Before adsorption, most tail fibers are folded onto the virion and extend only upon attachment to the cell. The internal core is then ejected and spans the double membrane. From Hu et al. (2013). Reprinted with permission from AAAS.
(C) Cryo-EM structure of the T4 baseplate before and after adsorption. The baseplate undergoes extensive structural changes, and the short tail fibers are extended to allow irreversible adsorption. Reprinted by permission from Macmillan Publishers: Nature (Taylor et al., 2016), copyright 2016.


...EM OBRAS...


Infelizmente, a irracionalidade acarretou a falta do medicamento para pacientes que realmente precisam. Assim, chamamos os farmacêuticos à responsabilidade:
Proíbam em seus estabelecimentos a venda de Cloroquina sem prescrição médica.
A Anvisa já reforçou o controle com a publicação da RDC 351/2020, que categoriza todos os medicamentos à base de cloroquina ou hidroxicloroquina como controlado, sujeitos a controle especial e escrituração pelo farmacêutico.


Ressaltamos que o uso indiscriminado de cloroquina pode trazer consequências graves. Portanto, antes da dispensação precisamos entender que:

1. A cloroquina é indicada para profilaxia e tratamento de ataque agudo de malária causado por Plasmodium vivax, P. ovale e P. malarie. Também está indicada no tratamento de amebíase hepática e, em conjunto com outros fármacos, tem eficácia clínica na artrite reumatoide, no lúpus eritematoso sistêmico e lúpus discoide, na sarcaidose (doença inflamatória multisistêmica) e nas doenças de fotossensibilidade como a porfiria cutânea tardia e as erupções polimórficas graves desencadeadas pela luz (nenhuma dessas doenças são causadas por vírus).

2. A margem de segurança da cloroquina é baixa. O envenenamento agudo por cloroquina é extremamente perigoso e a morte pode ocorrer em poucas horas. Esta pode ocorrer após a ingestão, por adultos, de uma única dose de 1,5-2,0 g, isto é 2-3 vezes a dose diária para o tratamento. Os sintomas de envenenamento incluem cefaléia, náusea, diarréia, tontura, fraqueza muscular e visão turva. Entretanto, o principal efeito da superdosagem é a toxicidade cardiovascular, com hipotensão, arritmias cardíacas e parada cardíaca irreversível. Se o paciente for examinado poucas horas depois da administração excessiva por via oral, é necessário induzir o vômito ou fazer a lavagem gástrica o mais rapidamente possível. Caso contrário, o tratamento é sintomático e dirigido particularmente para manter as funções cardiovasculares e respiratórias.

3. O uso de cloroquina produz incidência baixa de toxicidade retiniana. Entretanto, sua ocorrência tem grande relevância por acometer a região macular com importante e irreversível comprometimento visual.

4. Apesar desse medicamento ser o de escolha para uso em larga escala devido à sua disponibilidade de aquisição em farmácias e drogarias, registro de segurança comprovado e custo relativamente baixo, a Anvisa reforça que, “para a inclusão de indicações terapêuticas novas em medicamentos, é necessário conduzir estudos clínicos em uma amostra representativa de seres humanos, demonstrando a segurança e a eficácia para o uso pretendido” (crfmg).

COVID-19

SARS-CoV & MERS-CoV 

O SARS-CoV-2 (ou 2019-nCoV) é o sétimo coronavírus conhecido que infecta humanos. Os vírus  SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 podem causar doença grave, enquanto HKU1, NL63, OC43 e 229E estão associados a sintomas leves. Nesta seção do blog vamos estudar a origem natural do vírus da COVID-19, a organização do genoma do SARS-CoV-2 a partir da análise comparativa de dados genômicos. Ofereceremos uma perspectiva sobre as características notáveis do genoma SARS-CoV-2 e discutiremos cenários onde essses notáeis vírus poderiam ter surgido. Análises científicas mostram claramente que o SARS-CoV-2 não é uma construção de laboratório ou um vírus propositalmente manipulado para causar doença. Este vírus pertence à linhagem B do gênero β-coronavírus (Zhu et al., 2020) e compartilha características importantes com outros coronaviírus que infectam mamíferos e aves. (ver trabalho de Andersen et al., 2020).


a) Mutações em resíduos da proteína spike (S) do SARS-CoV-2, em contato. A proteína Spike do SARS-CoV-2 (barra vermelha no topo) foi comparada com os coronavírus tipo SARS-CoV mais próximos (mais estreitamente relacionados) e com o próprio SARS-CoVOs resíduos-chave na proteína S que fazem contato com o receptor ACE2 são marcados com caixas azuis no SARS-CoV-2 e vírus relacionados, incluindo SARS-CoV (cepa Urbani). b) Aquisição do sitio de clivagem polibásico e glicanos O-ligados. Ambos, os sitios polibásicos de clivagem e os três  glicanos-O-ligados preditos são exclusivos do SARS-CoV-2, e não foram visto previamente em betacoronavírus da linhagem B. As sequências mostradas são do NCBI GenBank, códigos de acesso MN908947, MN996532, AY278741, KY417146 e MK211376. As sequências do coronavírus de pangolin são um consenso gerado a partir de SRR10168377 e SRR10168378 (NCBI BioProject PRJNA573298) 29,30.
a) Mutations in contact residues of the SARS-CoV-2 spike protein. The spike protein of SARS-CoV-2 (red bar at top) was aligned against the most closely related SARS-CoV-like coronaviruses and SARS-CoV itself. Key residues in the spike protein that make contact to the ACE2 receptor are marked with blue boxes in both SARS-CoV-2 and related viruses, including SARS-CoV (Urbani strain). b) Acquisition of polybasic cleavage site and O-linked glycans. Both the polybasic cleavage site and the three adjacent predicted O-linked glycans are unique to SARS-CoV-2 and were not previously seen in lineage B betacoronaviruses. Sequences shown are from NCBI GenBank, accession codes MN908947MN996532AY278741KY417146 and MK211376. The pangolin coronavirus sequences are a consensus generated from SRR10168377 and SRR10168378 (NCBI BioProject PRJNA573298)29,30.

Acima é mostrada uma árvore de probabilidade máxima IQ-TREE de representantes de vírus únicos de treze espécies e cinco representantes da espécie Coronavírus relacionado à síndrome respiratória aguda grave do gênero Betacoronavirus. A árvore está enraizada com HCoV-NL63 e HCoV-229E, representando duas espécies do gênero Alphacoronavirus. O texto em roxo destaca os vírus zoonóticos com patogenicidade variada em humanos; o texto laranja destaca os vírus respiratórios comuns que circulam em humanos. Os asteriscos indicam duas espécies de coronavírus cujas demarcações e nomes aguardam aprovação do ICTV e, portanto, esses nomes não estão em itálico.

Inicialmente, a classificação dos coronavírus foi amplamente baseada em reatividades sorológicas (cruzadas) para a proteína spike viral, mas agora é baseada em análises de sequências comparativas de proteínas replicativas. A escolha das proteínas e os métodos utilizados para analisá-las evoluíram gradativamente desde o início deste século. O CSG (Coronavirus Study Group) analisa atualmente 3CLpro, NiRAN, RdRp, ZBD e HEL1, dois domínios a menos do que anteriormente usado nas análises conduzidas entre 2009 e 2015. De acordo com nosso conhecimento atual, esses cinco domínios essenciais são os únicos conservados em todos os vírus da ordem Nidovirales. Eles são, portanto, usados ​​para a classificação por todos os grupos de estudo de nidovírus do ICTV  (coordenados pelo NSG). (nature, 2021, ncbi, 2020)

As comparações de alfa e betacoronavírus, existentes na literatura identificam duas características genômicas notáveis ​​do SARS-CoV-2: 

(i) com base em estudos estruturais e experimentos bioquímicos, o SARS-CoV-2 parece ser otimizado para ligação ao receptor humano ACE2.
 
(ii) a proteína spike do SARS-CoV-2 tem um site (local) plibásico funcional de clivagem (furina) no limite S1-S2 através da inserção de 12 nucleotídideos, o que adicionalmente leva à aquisição prevista de 3 O-glicanos ligados ao redor do site.
((ii) the spike protein of SARS-CoV-2 has a functional polybasic (furin) cleavage site at the S1–S2 boundary through the insertion of 12 nucleotides8, which additionally led to the predicted acquisition of three O-linked glycans around the site).

Alguns coronavírus podem causar síndromes respiratórias graves, como a síndrome respiratória aguda grave que ficou conhecida pela sigla SARS da síndrome em inglês “Severe Acute Respiratory Syndrome”. A SARS é causada pelo coronavírus associado à SARS (SARS-CoV), sendo os primeiros relatos na China em 2002. O SARS-CoV se disseminou rapidamente para mais de doze países, na América do Norte, América do Sul, Europa e Ásia, infectando mais de 8.000 pessoas e causando entorno de 800 mortes, antes da epidemia global de SARS ser controlada em 2003. Desde então (2004 até hoje), nenhum caso de SARS tem sido relatado mundialmente.

Em 2012, foi isolado outro novo coronavírus, distinto daquele que causou a SARS no começo da década passada. Esse novo coronavírus era desconhecido como agente de doença humana até sua identificação, inicialmente na Arábia Saudita e, posteriormente, em outros países do Oriente Médio, na Europa e na África. Todos os casos identificados fora da Península Arábica tinham histórico de viagem ou contato recente com viajantes procedentes de países do Oriente Médio: Arábia Saudita, Catar, Emirados Árabes e Jordânia. 

Pela localização dos casos, a doença passou a ser designada como síndrome respiratória do Oriente Médio, cuja sigla é MERS, do inglês “Middle East Respiratory Syndrome” e o novo vírus nomeado coronavírus associado à MERS (MERS-CoV).

HISTÓRIA

Os coronavírus tem uma grande diversidade de hospedeiros entre aves e mamíferos. Esses vírus estão associados com doenças respiratórias, entéricas, hepáticas e neurológicas. É um vírus envelopado.
Genoma: possui o maior genoma entre os vírus de RNA (~29 pares de bases) de fita simples de sentido positivo ssRNA(+). Esse vírus usa uma enzima de replicase de DNA (ou uma polimerase de RNA dependente de RNA) em sua replicação (não apresentando uma transcriptase reversa).

Foi identificado pela primeira vez na década de 60, infectando humanos (cepa HCoV-229E), e sabe-se que pode infectar um grande número de animais, principalmente mamíferos e aves (mas não são limitados a esses, há registro de que repteis também sejam infectados por coronavírus).

Ordem: Nidovirales
Família: Coronaviridae
Subfamília: Orthocoronavirinae
Gêneros:
Alphacoronavirus, Betacoronavirus: predomina em mamíferos
Gammacoronavirus, Deltacoronavirus: predominante em aves.















Structure of the SARS-CoV-2 virion.
Partícula de β-coronavírus e seu genoma (A) A partícula (vírion) de β-coronavírus. O β-coronavírus é um vírus cujo genoma é de RNA de fita simples de sentido positivo, não segmentado e com envelope, em um tamanho que varia de 29,9 kb. O vírion possui um nucleocapsídio composto de RNA genômico e proteína nucleocapsídio fosforilado (N), que esta ancorada dentro da bicamada fosfolipídicas e coberta pelas glicoproteína "spike" trímeras (S). A proteína de membrana (M), hemaglutinina esterase (HE) e a proteína do envelope (E) estão localizadas entre as proteínas S no envelope do vírus. (B) sequências terminais 5' e 3' do genoma SARS-CoV-2. A ordem dos gene da é 5' replicase ORF1ab-S-envelope (E) membrana (M) N-3'. ORF3ab, ORF6, ORF7ab, ORF8, ORF9ab e ORF10 estão localizados nas posições mostradas na figura acima. 
β-coronavirus particle and genome [9] (A) The β-coronavirus particle. β-coronavirus is an enveloped, nonsegmented, positive-sense single-stranded RNA virus genome in a size ranging from 29.9 kb. The virion has a nucleocapsid composed of genomic RNA and phosphorylated nucleocapsid (N) protein, which is buried inside phospholipid bilayers and covered by the spike glycoprotein trimmer (S). The membrane (M) protein hemagglutinin esterase (HE) and the envelope (E) protein are located among the S proteins in the virus envelope. (B) 5 ′ and 3 ′ terminal sequences of the SARS-CoV-2 genome. The order gene is 5′-replicase ORF1ab-S-envelope (E)-membrane (M)-N-3′. ORF3ab, ORF6, ORF7ab, ORF8, ORF9ab, and ORF10 are located at the predicted positions shown in the picture.

REPLICAÇÃO DO NOVO CORONAVIRUS: 
SARS-CoV-2
O vírion e o genoma do SARS-Cov-2

Os coronavírus são vírus de RNA de fita simples com envelope relativamente grande, sentido positivo (aproximadamente 29,9 kb) ssRNA(+). O sentido positivo possibilita que esse RNA ao entrar no citoplasma da célula hospedeira, seja imediatamente transcrito em suas proteínas estruturais e não estruturais. 
O genoma SARS-CoV-2 codifica quatro proteínas estruturais e outras proteínas acessórias ou não estruturais (nsp), incluindo uma replicase pp1a-pp1ab viral, a protease semelhante a 3C (3CLpro), a protease semelhante à papaína (PLpro) e a RNApolimerase dependente de RNA, ou RdRp) (Fehr & Perlman, 2015, Zhou, P. et al., 2020).
 
As proteínas estruturais do SARS-CoV-2 são listadas a seguir. 

1) Proteína de superfície Spike (S) forma grandes estruturas triméricas que são essenciais para a entrada nas células hospedeiras após a ligação ao receptor e fusão da membrana. As proteínas spike são direcionadas por anticorpos neutralizantes do hospedeiro. 
2) O Proteína do envelope (E) está presente apenas em pequenas quantidades e provavelmente forma canais iônicos. As proteínas E não são necessariamente usadas para a replicação viral, mas são essenciais para a infectividade e patogênese. 
3) Proteína Matriz/Membrana (M) é a proteína estrutural mais abundante do vírus. As proteínas M são responsáveis ​​pela curvatura da membrana do envelope viral, notadamente por meio de sua interação com as proteínas E. 
4) O Proteínas do nucleocapsídeo (N) se liga ao genoma do RNA viral e garante a manutenção do RNA em uma conformação de "contas em um fio", ou um colar de pérolas. Observe a figura a seguir que detalha essa conformação do vírus.


O Coronavírus SARS-CoV-2 é um vírus de RNA de cadeia simples, com cerca de 29.903 nucleotídeos, aproximadamente 29,9 kB, na qual se reconhece 13 genes que codificam para 14 proteínas conhecidas.
Apresenta uma longa ORF1ab (ORF: Open Reading Frame) na posição 5’ que codifica proteínas ORF não estruturais, seguido de quatro genes para proteínas estruturais: proteína de superfície (S), proteína do envelope (E), proteína da membrana (M) e proteína do nucleocapsídeo (N).

Estrutura do vírion SARS-CoV-2

Os coronavírus patogênicos humanos (coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV e SARS-CoV-2) se ligam às células-alvo através da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2), que é expressa pelas células epiteliais do pulmão, intestino, rim, e vasos sanguíneos.
A expressão da ECA2 é substancialmente aumentada em pacientes com diabetes tipo 1 ou tipo 2, que são tratados com inibidores da ECA e bloqueadores dos receptores da angiotensina II tipo I (BRA). 
A hipertensão também é tratada com inibidores da ECA e BRA, o que resulta em uma regulação positiva da ACE2. A ACE2 também pode ser aumentada por tiazolidinedionas e ibuprofeno. Esses dados sugerem que a expressão da ACE2 é aumentada no diabetes e o tratamento com inibidores da ECA e BRA aumenta a expressão da ACE2. 
Consequentemente, o aumento da expressão de ACE2 facilitaria a infecção por COVID-19. Portanto, supomos que o tratamento do diabetes e da hipertensão com medicamentos estimulantes da ECA2 aumente o risco de desenvolver COVID-19 grave e fatal. 

Os genomas de vírus de RNA de fita positiva, como o coronavírus, pode atuar como mRNA (RNA mensageiro) e ser diretamente traduzido em proteínas no citoplasma das células hospedeiras. Os intermediários de RNA de fita negativa também são produzidos por coronavírus que servem como moldes para: síntese de fita positiva de RNA genômico, que é então empacotado pelas proteínas estruturais para montar a prole do vírion; e transcritos de RNA subgenômicos. 

Vários Open Reading Frame “quadros de leitura aberta” (ORFs) foram distinguidos dentro da sequência do "corpo" do genoma SARS-CoV-2, correspondendo a elementos estruturais virais (proteínas N, S, E e M) e genes acessórios. A proteína N, ou nucleocapsídeo, encapsula o genoma, enquanto as proteínas S (spike), E (envelope) e M (membrana) constituem o envelope de bicamada lipídica circundante. O envelope esta possivelmente reduzido a canais iônicos. 

De particular importância é a proteína S, que permite a infecção viral através do reconhecimento do receptor ACE-2 do hospedeiro e fusão do envelope viral com a membrana celular. O ORF mais 5', ORF 1a/1b, também conhecida como o gene replicase/transcriptase) é relatado em coronavírus para codificar polimerases para a síntese de RNA viral e outras proteínas não estruturais (nsps) (por exemplo, para cauda poli-A.
Isso significa dizer que o Sars-CoV-2, compartilha com outros 29 tipos de vírus algumas características como:

(i) RNA de fita simples positiva, (+) ssRNA(+),
(ii) São os mais abundantes do planeta, com um genoma linear que varia entre 2,3 e 32 kpb (pares de bases),
(iii) O genoma viral poder ser constituído por um único segmento ou por várias moléculas de RNA.
(iv) São vírus com capsídeos de simetria icosaédrica ou helicoidal.
(v) Os vírions deste grupo podem ser envelopados ou não (vírus nus).
(vi) No envelope apresentam peplômeros ou espículas (que em imagens de microscopia eletrônica assemelham-se a coroa solar).
(vii) A extremidade 5' do genoma possue um cap 5' e a 3'  uma cauda poli-A.
(viii) Seu envelope (adquirido ao brotar da membrana do retículo endoplasmático e do complexo de Golgi), invariavelmente apresenta glicoproteínas específicas do vírus, chamadas de S e M.
(ix) A glicoproteína S constitui as grandes projeções superficiais do envelope (que forma a coroa nas microfotografias eletrônicas).
(x) A glicoproteína transmembranar M é uma proteína que atravessa três vezes a membrana do envelope;
(xi) O nucleocapsideio apresenta uma fosfoproteína, N.
(xii) Alguns vírus desse grupo possuem peplômeros HE com atividade de hemaglutinina mais acetilesterase.

Todo o ciclo de replicação ocorre no citoplasma, maturação de proteinas no reticulo endoplasmático e no complexo de Golgi e é relativamente lento. Após a adsorção, a penetração (endocitose) e o desnudamento, a molécula de RNA do vírion que entra é traduzida diretamente, um dos produtos sendo uma polimerase de RNA, RNA dependente (RdRp) que, em seguida, transcreve um RNA completo de sentido negativo, do qual é transcrito um "conjunto aninhado" 3'-co-terminal de mRNAs subgenômicos. 
Esse conjunto aninhado compreende cinco a sete espécies sobrepostas de mRNAs que se estendem por diferentes comprimentos a partir de um terminal 3' comum. O RNA genômico e todos os mRNAs têm uma sequência líder de 5' idêntica de cerca de 72 nucleotídeos.
Consequentemente, o conjunto aninhado de mRNAs é formado pelo mecanismo incomum de unir dois RNAs não contíguos. A união da sequência líder 5' com a parte restante de cada mRNA ocorre durante a transcrição.

Resumindo: após a liberação do RNA genômico de fita (+) no citoplasma, é sintetizada uma RNA polimerase dependente de RNA, que transcreve um RNA de fita (-) completo, a partir do qual são sintetizados (a) novo RNA genômico, (b) uma série sobreposta de mRNAs subgenômicos e (c) o RNA líder.

Modified from K. V. Holmes, In "Fields Virology" (B. N. Fields et al., eds.), 2nd Ed., p. 847. Raven, New York, 1990.1

O RNA genômico e os mRNAs são limitados e poliadenilados (linha em ziguezague na figura acima) e formam um "conjunto aninhado" com extremidades 3 'comuns e uma sequência líder comum na extremidade 5'. Apenas a sequência única dos mRNAs na extremidade 5' é traduzida, para produzir várias proteínas não estruturais (NS ou nsp) e quatro proteínas estruturais: M (EI), glicoproteína transmembranar; S (E2), glicoproteína peplomérica; N, nucleoproteína; e em alguns coronavírus HE (E3), glicoproteína hemaglutinina-esterase. A maturação e a montagem ocorrem no retículo endoplasmático rugoso e no Golgi, e os vírions são liberados por exocitose.

Estudos recentes indicam que a patogenicidade e a virulência do SARS-CoV-2, está associada a alta afinidade com os receptores de enzima conversora da angiotensina 2 (ACE2), uma aminopeptidase ligada à membrana que é altamente expressa no coração e nos pulmões, mas encontrada na superfície de vários tipos de células humanas, sendo que esta ligação, eficiente e estável, parece também facilitar a dispersão viral de pessoa-para-pessoa.

A ACE2 é uma proteína transmembrana expressa na superfície de diversas células do corpo, como o epitélio do sistema respiratório. Vários estudos já demonstraram a relação entre a proteína ACE2 com os mecanismos de entrada de alguns coronavírus, como o HCoV-NL63, o SARS-CoV e o novo SARS-CoV-2 (causador da COVID-19). (Damasio, 2020).


Qual a função do gene ACE2 em nosso organismo?

A princípio, o gene da ACE2 é responsável pela expressão da proteína de mesmo nome, ACE2 (da sigla em inglês: Angiotensin-Converting Enzyme 2). Essa proteína está expressa na superfície das células, ela nada mais é, do que um homólogo da já conhecida ACE (em português: ECA), responsável pela regulação da pressão arterial dentro do Sistema Renina-Angiotensina.(Damasio, 2020)
A proteína variante ACE2, descoberta no ano 2000, é muito semelhante em estrutura (cerca de 42%) mas faz o papel inverso da ACE.
Enquanto a ACE faz vasoconstrição e consequentemente o aumento da pressão arterial, a ACE2 promove a vasodilatação e diminui a pressão arterial. Dessa forma é feita a regulação do Sistema Renina-Angiotensina.

Apesar de a ACE2 ser a porta de entrada do vírus nas células, foi mostrado em alguns artigos que a ação da ACE2 tem efeito protetor contra danos pulmonares causados por infecções virais. Consequentemente, os estudos mostraram que a diminuição nos níveis dessa proteína pode causar ainda mais danos aos pulmões de quem está infectado. (Damasio, 2020).

Coronavirus polyprotein processing and non structural proteins

O processamento da poliproteína de coronavírus e os domínios de proteínas não estruturais (nsp) são ilustrados para coronavírus relacionados com a síndrome respiratória aguda grave. A clivagem proteolítica das poliproteínas pp1a e pp1ab é facilitada por proteases virais que residem em nsp3 (PLpro) e nsp5 (Mpro). PLpro libera proteoliticamente nsp1, nsp2, nsp3 e o terminal amino de nsp4 das poliproteínas pp1a e pp1ab (indicadas pelas setas azuis). Mpro libera proteoliticamente o nsp5-16 e o ​​terminal carboxi do nsp4 das poliproteínas pp1a e pp1ab (indicadas pelas setas vermelhas). Domínios conservados e funções conhecidas são esquematicamente representados para nsp1–16. DMV, vesícula de membrana dupla; DPUP, Domínio que precede Ubl2 e PLpro; EndoU, endoribonuclease; ExoN, exoribonuclease; HEL, helicase; Mac I-III, macrodomínios 1–3; Mpro, protease principal; NiRAN, nucleotidiltransferase associada a nidovírus RdRP; NMT, guanosina N7-metiltransferase; OMT, ribose 2'-O-metiltransferase; PLpro, protease semelhante à papaína; Prprimase ou 3' terminal Adenilil-transferase, RdRP, RNA polimerase dependente de RNA; TM, domínios transmembranares; Ubl, domínio do tipo ubiquitina; Domínio; Y, dominio Y e CoV-Y; ZBD, domínio da ligação de zinco. (V'kovski et al. 2020)

Coronavirus polyprotein processing and domains of non-structural proteins (nsp) are illustrated for severe acute respiratory syndrome-related coronaviruses. Proteolytic cleavage of the polyproteins pp1a and pp1ab is facilitated by viral proteases residing in nsp3 (PLpro) and nsp5 (Mpro). PLpro proteolytically releases nsp1, nsp2, nsp3 and the amino terminus of nsp4 from the polyproteins pp1a and pp1ab (indicated by the blue arrows). Mpro proteolytically releases nsp5–16 and the carboxy terminus of nsp4 from the polyproteins pp1a and pp1ab (indicated by the red arrows). Conserved domains and known functions are schematically depicted for nsp1–16. DMV, double-membrane vesicle; DPUP, Domain Preceding Ubl2 and PLpro; EndoU, endoribonuclease; ExoN, exoribonuclease; HEL, helicase; Mac I–III, macrodomains 1–3; Mpro, main protease; NiRAN, nidovirus RdRP-associated nucleotidyltransferase; NMT, guanosine N7-methyltransferase; OMT, ribose 2′-O-methyltransferase; PLpro, papain-like protease; Pr, primase or 3′-terminal adenylyl-transferase; RdRP, RNA-dependent RNA polymerase; TM, transmembrane domains; Ubl, ubiquitin-like domain; Y, Y and CoV-Y domain; ZBD, zinc-binding domain.
Replicação do  transcrição descontinua do genoma do vírus SARS-CoV-2.
Representação esquemática da síntese de RNA coronaviral. O RNA genômico de sentido positivo de comprimento total é usado como um modelo para produzir cópias de sentido negativo de comprimento total para a replicação do genoma e RNAs de sentido negativo subgenômico [sgRNA(–)] para produzir os mRNAs subgenômicos (sg mRNA). É ilustrada a síntese de RNA de fita negativa envolvendo uma mudança de molde de uma sequência reguladora de transcrição do corpo (TRS-B) para o TRS líder (TRS-L) para produzir um sg mRNA. Este processo pode ocorrer em qualquer TRS-B e resultará coletivamente na produção do característico conjunto aninhado de mRNAs coronavirais. (V'kovski et al. 2020)
Schematic depiction of coronaviral RNA synthesis. Full-length positive-sense genomic RNA is used as a template to produce both full-length negative-sense copies for genome replication and subgenomic negative-sense RNAs (–sgRNA) to produce the subgenomic mRNAs (sg mRNA). The negative strand RNA synthesis involving a template switch from a body transcription regulatory sequences (TRS-B) to the leader TRS (TRS-L) is illustrated to produce one sg mRNA. This process can take place at any TRS-B and will collectively result in the production of the characteristic nested set of coronaviral mRNAs.

                                   
a) Os genomas de RNA de fita simples (ssRNA) do coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV) e do coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV) codificam duas grandes poliproteínas, pp1a e pp1ab, que são proteoliticamente clivadas em 16 proteínas estruturais (nsps), incluindo protease do tipo papaína (PLpro), protease do tipo 3C (3CLpro), RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), helicase (Hel) e exonuclease (ExoN). Outros 9-12 ORFs são codificados através da transcrição de um conjunto aninhado de RNAs subgenômicos. SARS-CoV e MERS-CoV formam partículas esféricas que consistem em quatro proteínas estruturais. O pico da glicoproteína do envelope (S) forma uma camada de glicoproteínas que se projetam do envelope. Duas glicoproteínas transmembranares adicionais são incorporadas no vírion: envelope (E) e membrana (M). Dentro do envelope viral reside o nucleocapsídeo helicoidal, que consiste no genoma do RNA de sentido positivo viral (+RNA) encapsidado pela proteína nucleocapsídeo (N). 

Diagrama esquemático que mostra o ciclo de replicação do coronavírus e os estágios nos quais o estresse do ER pode ser induzido durante a infecção pelo coronavírus. A infecção começa com a ligação ao receptor e entrada por fusão da membrana. Após a remoção do revestimento, o RNA genômico é usado como molde para sintetizar genomas de progênie e um conjunto aninhado de RNAs subgenômicos. Os centros de transcrição de replicação estão intimamente associados aos DMVs, que são propostos para serem adotados a partir do ER modificado, possivelmente pelas atividades combinadas das proteínas não estruturais nsp3, nsp4 e nsp6. As proteínas S, E e M são sintetizadas e ancoradas no ER, enquanto a proteína N é traduzida no citosol. A montagem ocorre no ERGIC e os vírions maduros são liberados por meio de vesículas de parede lisa por exocitose. Os três estágios que presumivelmente induzem estresse ER são destacados com estrelas numeradas, a saber: (1) formação de DMVs, (2) produção massiva e modificação de proteínas estruturais, e (3) esgotamento da membrana ER durante o brotamento.
Schematic diagram showing the replication cycle of coronavirus and the stages in which ER stress may be induced during coronavirus infection. Infection starts with receptor binding and entry by membrane fusion. After uncoating, the genomic RNA is used as a template to synthesize progeny genomes and a nested set of subgenomic RNAs. The replication transcription centers are closely associated with DMVs, which are proposed to be adopted from the modified ER, possibly by the combined activities of non-structural proteins nsp3, nsp4, and nsp6. The S, E, and M proteins are synthesized and anchored on the ER, whereas the N protein is translated in the cytosol. Assembly takes place in the ERGIC and mature virions are released via smooth-walled vesicles by exocytosis. The three stages that presumably induce ER stress are highlighted with numbered star signs, namely: (1) formation of DMVs, (2) massive production and modification of structural proteins, and (3) depletion of ER membrane during budding.

b) Após a entrada do vírus na célula hospedeira, o RNA viral não é revestido no citoplasma. ORF1a e ORF1ab são traduzidos para produzir pp1a e pp1ab, que são clivados pelas proteases e que são codificadas por ORF1a para produzir 16 nsps que formam o complexo RNA replicase-transcriptase. Esse complexo localiza-se nas membranas intracelulares modificadas que são derivadas do retículo endoplasmático rugoso (ER) na região perinuclear e direciona a produção de RNAs de sentido negativo (-RNAs) por meio de replicação e transcrição. (V'kovski et al. 2021)

Durante a replicação, cópias de RNA de comprimento total (-) do genoma são produzidas e usadas como modelos para genomas de RNA de comprimento total (+). Durante a transcrição, um subconjunto de 7 a 9 RNAs subgenômicos, incluindo aqueles que codificam todas as proteínas estruturais, é produzido através da transcrição descontínua. Nesse processo, os RNAs subgenômicos (-) são sintetizados combinando comprimentos variados da extremidade 3' do genoma com a sequência líder 5' necessária para a tradução. Esses RNAs subgenômicos (-) são então transcritos em mRNAs subgenômicos (+). 

Embora os diferentes mRNAs subgenômicos possam conter várias ORFs, apenas a primeira ORF (a mais próxima da extremidade 5') é traduzida. As proteínas estruturais resultantes são montadas no envelope e nucleocapsídeo viral no compartimento intermediário ER-Golgi (ERGIC), seguido pela liberação do vírion nascente da célula infectada.

a) The single-stranded RNA (ssRNA) genomes of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) encode two large polyproteins, pp1a and pp1ab, which are proteolytically cleaved into 16 non-structural proteins (nsps), including papain-like protease (PLpro), 3C-like protease (3CLpro), RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), helicase (Hel) and exonuclease (ExoN). An additional 9–12 ORFs are encoded through the transcription of a nested set of subgenomic RNAs. SARS-CoV and MERS-CoV form spherical particles that consist of four structural proteins. The envelope glycoprotein spike (S) forms a layer of glycoproteins that protrude from the envelope. Two additional transmembrane glycoproteins are incorporated in the virion: envelope (E) and membrane (M). Inside the viral envelope resides the helical nucleocapsid, which consists of the viral positive-sense RNA ((+)RNA) genome encapsidated by protein nucleocapsid (N). b) Following entry of the virus into the host cell, the viral RNA is uncoated in the cytoplasm. ORF1a and ORF1ab are translated to produce pp1a and pp1ab, which are cleaved by the proteases that are encoded by ORF1a to yield 16 nsps that form the RNA replicase–transcriptase complex. This complex localizes to modified intracellular membranes that are derived from the rough endoplasmic reticulum (ER) in the perinuclear region, and it drives the production of negative-sense RNAs ((−)RNAs) through both replication and transcription. During replication, full-length (−)RNA copies of the genome are produced and used as templates for full-length (+)RNA genomes. During transcription, a subset of 7–9 subgenomic RNAs, including those encoding all structural proteins, is produced through discontinuous transcription. In this process, subgenomic (−)RNAs are synthesized by combining varying lengths of the 3′ end of the genome with the 5′ leader sequence necessary for translation. These subgenomic (−)RNAs are then transcribed into subgenomic (+)mRNAs. Although the different subgenomic mRNAs may contain several ORFs, only the first ORF (that closest to the 5′ end) is translated. The resulting structural proteins are assembled into the nucleocapsid and viral envelope at the ER–Golgi intermediate compartment (ERGIC), followed by release of the nascent virion from the infected cell.

a) O vírion do coronavírus consiste em proteínas estruturais, principalmente a proteína Spike (S), proteina do envelope (E), proteina de membrana (M), do nucleocapsídeo (N) e, para alguns betacoronavírus, hemaglutinina-esterase (não mostrado). O genoma de RNA de fita simples de sentido positivo ssRNA (+) é encapsidado por N, enquanto M e E garantem sua incorporação na partícula viral durante o processo de montagem. Os trímeros S projetam-se do envelope viral derivado do hospedeiro e fornecem especificidade para os receptores de entrada celular. 

b) As partículas de coronavírus se ligam a fatores de fixação celular e as interações S específicas com os receptores celulares, como a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2), juntamente com fatores do hospedeiro, como a serina protease da superfície celular TMPRSS2, promovem a absorção viral e a fusão no membrana celular ou endossomal. Após a entrada (endocitose), a liberação (desnudamento) e o desencapsulamento do RNA genômico de entrada é submetido à tradução imediata de duas grandes estruturas de leitura aberta, ORF1a e ORF1b. As poliproteínas pp1a e pp1ab resultantes são processadas ao mesmo tempo que acontece a tradução e após a tradução (The resulting polyproteins pp1a and pp1ab are co-translationally and post-translationally processed into the individual non-structural proteins nsps)  nas proteínas não estruturais individuais (nsps) que formam o complexo de replicação e transcrição viral. 
Concordante com a expressão de nsps, a biogênese de organelas de replicação viral consistindo em vesículas de membrana dupla perinuclear características (DMVs), membranas convolutas (CMs) e pequenas esférulas de membrana dupla abertas (DMSs) criam um microambiente protetor para a replicação de RNA genômico viral e transcrição de mRNAs subgenômicos (sg mRNAs) compreendendo o conjunto aninhado característico de mRNAs de coronavírus. 
As proteínas estruturais traduzidas se translocam para as membranas do retículo endoplasmático (ER) e transitam através do compartimento intermediário ER-para-Golgi (ERGIC), onde a interação com o RNA genômico N-encapsidado recém-produzido resulta em brotamento no lúmen dos compartimentos vesiculares secretores. 
Finalmente, os vírions são secretados da célula infectada por exocitose. As principais etapas inibidas por compostos que estão sendo validados e que representam alvos antivirais atraentes estão destacadas em vermelho. Sequência de cap poliA, 3'; estrutura de cap 5′; dsRNA, RNA de fita dupla; L, sequência líder; RdRP, RNA polimerase dependente de RNA.




Eventos iniciais durante a infecção de HCoV-NL63.


YFV
Yellow Fever virus
VÍRUS DA FEBRE AMARELA SILVESTRE (FAS) 
VÍRUS DA FEBRE AMARELA URBANA (FAU)


ASPECTOS CLÍNICOS E EPIDEMIOLÓGICOS

Febre Amarela
A Febre Amarela é uma doença infecciosa febril aguda, não contagiosa de curta duração (no máximo 12 dias) e de gravidade variável, cujo agente etiológico é um vírus envelopado chamado Yellow Fever Virus (YFV). Existem sete genótipos do YFV circulando no mundo: cinco genótipos em diferentes regiões da África (genótipo Africano Ocidental, Central, Africano Oeste, genótipo do Leste, genótipo Angola) e dois genótipos na América do Sul (genótipo I e II da América do Sul) (Barret, 2010, Ribeiro, 2014).

Origem da Febre Amarela

Existe ainda considerável dúvida sobre a origem desta infecção, com alguns estudiosos argumentando que teve sua provável origem no continente africano, tendo se dispersado pelo mundo juntamente com seu mosquito vetor clássico urbano, o Aedes (Stegomyia) aegypti (L.1762), com o tráfico dos escravo, tendo os ovos do mosquito vindo nos barris de água e a doença com os povos escravizados.

Há os que defendem a origem americana para a febre amarela, citando que em 1495, durante a segunda expedição de Cristóvão Colombo, os espanhóis travaram contra os indígenas a batalha de Vega-Real ou Santo Serro, na ilha Espanhola (hoje Haiti). Cêrca de dois meses depois desta batalha, irrompeu uma epidemia, tanto entre os europeus como entre os indígenas, fazendo numerosas vítimas. Os sintomas descritos, embora incompletos, e a elevada mortalidade, permitiram a Béranger-Féraud chegar à conclusão de “que se pode admitir sem hesitação que esta doença era febre-amarela”. (Franco, 1969)

Outro estudioso Miguel E. Bustamante, em sua obra “A Febre-Amarela no México e sua Origem na América”, apresentou os resultados de seus estudos, inclusive dos documentos da civilização Maia, para concluir que, antes dos espanhóis chegarem pela primeira vez a terras americanas, os Maias já haviam registrado a existência de uma grave enfermidade que denominavam “xekik” ou seja “vômito de sangue”, aludindo ao sintoma que maior impressão lhes havia causado. A doença se apresentava por surtos epidêmicos, parecendo vir do fundo das selvas para invadir as povoações e dizimar seus habitantes.(Franco, 1969)

Todavia, foi o jesuíta Raymond Bréton o primeiro a se referir à febre-amarela com relativa precisão, ao relatar a epidemia que ocorreu em 1635 entre os imigrantes francêses na ilha de Guadalupe e que, ao lado de outros sintomas, provocava dores lombares, icterícia (“os doentes ficavam mais amarelos do que marmelos”) e vômitos negros, sendo que a morte sobrevinha do terceiro ao quinto dia. Bréton estabeleceu, ainda, uma nítida relação entre a derrubada de árvores e a doença, ao registrar que “à medida que cortavam os bosques, a terra arrojava seu veneno”.(Franco, 1969)

O padre Du Tertre que chegou àquela ilha cinco anos depois – em 1640 quando ainda grassava a doença, fez também um relato dessa epidemia, e confirmou que as pessoas atacadas de “golpe de barra” estavam ocupadas no corte de matas. Atribuiu a febre aos vapores venenosos que a queda das árvores exalava. O nome “golpe de barra” proveio da dor violenta na região lombar, e que muita aflição causava aos pacientes. Alguns historiadores consideram os relatos de Bréton e Du Tertre como a primeira descrição aceitável de uma epidemia de febre-amarela. É interessante ressaltarmos que esse relato apresenta as características da forma silvestre da doença. Os nativos chamavam-na de “pouliccatina”, que significa “coup de barre” nome dado pelos franceses à doença. A epidemia reapareceu na ilha de Guadalupe em 1648; nesse mesmo ano eclodiu em Yucatan, no México.(Franco, 1969)

Carter, Scott, Soper e outros admitem que a epidemia de Yucatan foi o primeiro surto possível de identificar-se, com segurança, como de febre-amarela, porque dessa epidemia frei Diego Lopez de Cogolludo fêz uma descrição detalhada. O manuscrito maia de Chumayll também se referiu a ela quando registrou: “Ocorreu vômito de sangue começando a morte para nosso povo no ano de 1648”. Porém outro livro dos maias registra a ocorrência da doença dos vômitos de sangue, três vêzes em épocas anteriores. Cogolludo ignorava qual a doença que estava descrevendo; aliás os próprios médicos não a conheciam. Todavia, hoje ela se nos apresenta como a descrição clara de uma epidemia de febre-amarela. Conta o historiógrafo, que a enfermidade começava com “uma gravíssima e intensa dor de cabeça e de todos os ossos do corpo, tão violenta, que parecia desconjuntarem-se e que uma prensa os comprimia. Pouco depois sobrevinha um calor intensíssimo, que à maioria ocasionava delírios, embora não a todos. Em seguida, alguns apresentavam-se com vômitos como de sangue podre, e dêstes poucos ficavam vivos”. Cogolludo observou e assim descreveu o período de remissão da febre-amarela: “Na maioria, no terceiro dia, a febre parecia ceder totalmente; diziam que já não sentiam dor alguma, cessava o delírio, conversavam com juízo, porém não podiam comer nem beber coisa alguma, e assim duravam outro ou outros dias e, dizendo que estavam bons, expiravam”. “Foram muitíssimos os que não passaram do terceiro dia; outros morreram entrando no quinto, e muito poucos chegaram ao sétimo”. Aquela estranha doença “aos mancebos mais robustos e saudáveis atacava com mais violência e acabava a vida mais depressa”.(Franco, 1969). Ao lermos o livro de Odair Franco "História da Febre Amarela no Brasil" vemos essas duas correntes de ideias e argumentos, entre tantas outras um tanto absurdas, outras menos, não havendo ainda, em minha opinião, elementos para elucidar tal questão. 


 O mosquito Aedes sp. é conhecido na literatura científica como "the yellow fever mosquito" e no Brasil como mosquito rajado. A febre amarela já foi considerada um dos maiores flagelos da humanidade nos séculos XVIII a XIX, causando epidemias devastadoras em aglomerações urbanas, especialmente em cidades portuárias. Sua transmissão vetorial foi descoberta na primeira década do século XX, com os estudos coordenados por Walter Reed em Cuba, em 1900-1901, quando conseguiu controlar a transmissão a partir do controle e vigilância do mosquito vetor. Baseados nestes resultados, no Brasil, Oswaldo Cruz e Emílio Ribas também enfrentaram epidemias com o combate ao vetor. (Lima, 2017)

Segundo Woodson, Freiber and Holbrook (2011), a infecção por YFV mostra uma taxa de mortalidade de 20-50% e é estimdo que aproximadamente 30.000 mortes ocorram anualmente devido a esta doença segundo dados da WHO (Organização Mundial de Saúde). O vírus 17-D é a cepa de YFV da vacina do vírus atenuado que normalmente é muito bem recebida por o vacinado e confere proteção por pelo menos 10 anos após uma inoculação única. O vírus 17-D tem sido usado por mais de 70 anos com mais de 500 milhões de doses administradas e com relativamente poucos eventos adversos graves (Monath et al., 2010).
Yellow fever virus (YFV) (family Flaviviridae, genus Flavivirus) is the causative agent of yellow fever (YF), an often fatal viral hemorrhagic fever. YFV infection carries a 20–50% mortality rate and it is estimated that approximately 30,000 deaths occur annually due to this disease (World Health Organization). The 17-D virus, is the liveattenuated vaccine strain of YFV that is typically very well-received by the vaccinee and confers protection for at least 10 years following a single inoculation. 17-D virus has been used for more than 70 years with over 500 million doses administered and with relatively few serious adverse events (Monath et al., 2010).

Apresenta-se como infecções subclínicas e/ou leves, até formas graves e fatais. 
O quadro típico tem evolução bifásica (período de infecção e de intoxicação), com inicio abrupto, febre alta e pulso lento em relação a temperatura (sinal de Faget), calafrios, cefaléia intensa, mialgias, prostração, náuseas e vômitos, durando cerca de 3 dias, após os quais se observa remissão da febre e melhora dos sintomas, que pode durar algumas horas ou, no máximo, dois dias. O caso pode evoluir para cura ou para a forma grave (período de intoxicação), que se caracteriza pelo aumento da febre, diarreia e reaparecimento de vômitos com aspecto de borra de café, instalação de insuficiência hepática e renal. Surgem também icterícia, manifestações hemorrágicas (hematêmase (vômito com sangue), melena (Fezes pastosas de cor escura e cheiro fétido, sinal de hemorragia digestiva alta. A cor escura se refere às modificações bioquímicas sofridas pelo sangue na luz intestinal colonizada por bactérias. Somente o sangue que se origina de fonte superior (como intestino delgado), ou sangramento de fonte inferior que ocorre lento o suficiente para permitir oxidação, são associados com Melena. Por essa razão, Melena é frequentemente associada com sangue no estômago ou duodeno (trato gastrointestinal superior), por exemplo úlcera péptica. Na Melena o sangue, que parece oculto, é indicado pela cor negra das fezes, enquanto que na hematoquezia pode haver sangue vivo aparente), epistaxe (sangramento ou hemorragia nasal, hemorrinia), sangramento vestibular e da cavidade oral, entre outras, oligúria (diminuição ou ausência de produção de urina), hematuria (presença de sangue na urina), albuminúria (perda de albumina pela urina) e prostração intensa, além de comprometimento do sensório, com obnubilação mental e torpor com evolução para coma. Epidemiologicamente, a doença pode se apresentar sob duas formas distintas: febre amarela urbana (FAU) e febre amarela silvestre (FAS), diferenciando-se uma da outra apenas pela localização geográfica, espécie vetorial e tipo de hospedeiro.

(Oligúria: excreção de urina < 500 mL/24 horas em adulto, ou < 0,5 mL/kg/h em adulto ou criança (< 1 mL/kg/h em neonatos)).

A Infecção YFV resulta em cinco patologias hepáticas distintas: lesões da zona média, esteatose, inflamação grave com inflamação desproporcional, infiltrado celular, degeneração eosinofílica de hepatócitos e células Kupffer (Councilman bodies), e após a resolução da infecção, um retorno completo à histologia normal (Monath e Barrett, 2003).(Woodson et al. 2011)

As células de Kupffer (KCs) são macrófagos  residentes do fígado responsáveis ​​pela detecção de patógenos e ativação de respostas imunes locais. KCs são um dos três principais tipos de células no fígado junto com hepatócitos e células endoteliais. Como um macrófago especialista, as principais funções das células de Kupffer são a fagocitose, apresentação de antígeno e recrutamento de células imunes adicionais para locais de inflamação no fígado. KCs são encontrados revestindo os sinusóides e tem contato direto com hepatócitos. Estudos anteriores indicam que as KCs são as primeiras a serem infectadas durante uma infecção por YFV, e por causa de sua função, pode ser um modulador importante do resposta imune no fígado (Bearcroft, 1957; Klotz e Belt, 1930; Smetana, 1962; Tigertt et al., 1960). (Woodson et al. 2011)
Células de Kupffer, como os macrofagos circulantes, pode também produzir um número de citocinas pró-inflamatório incluindo IL-8, TNF-a e RANTES/CCL5.
Kupffer cells, like circulating macrophages, can also produce a number of pro-inflammatory cytokines including IL-8, TNF-α and RANTES/CCL5. 

Um dos sintomas da febre amarela é a cor da pele e dos olhos, que se tornam amarelados (3). 

Distribuição das formas clínicas da febre amarela. (Vasconcelos, 2003)

As fases da febre amarela, indicando os sintomas clínicos nos períodos de infecção, remissão e intoxicação, ao lado da patogênese da infecção. (Gardner and Ryman, 2010). 
Cytokines (from Greek: cyto, from Greek "κύτος" kytos "cavity, cell" + kines, from Greek "κίνησις" kinēsis "movement") are a broad and loose category of small proteins (~5–20 kDa) important in cell signaling. Cytokines are peptides and cannot cross the lipid bilayer of cells to enter the cytoplasm. Cytokines have been shown to be involved in autocrine, paracrine and endocrine signaling as immunomodulating agents. Their definite distinction from hormones is still part of ongoing research. Cytokines include chemokines, interferons, interleukins, lymphokines, and tumour necrosis factors, but generally not hormones or growth factors (despite some overlap in the terminology). Cytokines are produced by a broad range of cells, including immune cells like macrophages, B lymphocytes, T lymphocytes and mast cells, as well as endothelial cells, fibroblasts, and various stromal cells; a given cytokine may be produced by more than one type of cell. They act through cell surface receptors and are especially important in the immune system; cytokines modulate the balance between humoral and cell-based immune responses, and they regulate the maturation, growth, and responsiveness of particular cell populations. Some cytokines enhance or inhibit the action of other cytokines in complex ways. They are different from hormones, which are also important cell signaling molecules. Hormones circulate in higher concentrations, and tend to be made by specific kinds of cells. Cytokines are important in health and disease, specifically in host immune responses to infection, inflammation, trauma, sepsis, cancer, and reproduction.


Agente etiológico

Vírus amarilico, arbovirus do gênero Flavivirus e família Flaviviridae. 

Os flavivírus são vírus envelopados, com capsídeo icosaédrico, de aproximadamente 25-40 nanômetros (nm). 

A partícula viral  íntegra (vírion) mede cerca de 40-50 nm. 

O YFV apresenta o genoma não-segmentado, constituído de RNA de fita simples e polaridade positiva, medindo cerca de 11kilobases (kb) de comprimento (CHAMBERS et al., 1990). 

Um RNA de fita simples de polaridade positiva, significa que pode ser traduzido imediatamente ao entrar no citoplasma da célula hospedeira. Aprsenta regiões não traduzidas (UTR) 5' e 3' altamente estruturadas, um cap terminal 5' e um único quadro de leitura aberto (ORF) que codifica as 10 proteínas virais, 3 estruturais e 7 não estruturais.

(A estrutura cap terminal ou Cap 5' é uma estrutura típica de mRNA eucariótico, a qual é gerada pela ligação 5'-5' trifosfato entre a extremidade 5' de uma molécula de mRNA precursora e um nucleotídeo alterado (GMP metilado). O Cap 5' protege o mRNA contra a ação de ribonucleases, proteção contra a ação de fosfatases e também é responsável por interagir com complexos protéicos que processam, exportam o mRNA para o citosol e promovem a ligação deste com os ribossomos).



Estrutura viral 

Genoma do YFV é uma fita simples de RNA de sentido positivo. (Fonte: europepmc)


Vírus da febre amarela (YFV)
O vírion (partícula viral) da febre amarela. A partícula do vírus é pequena, icosaédrica e envelopada. (A) Fotomicrografia mostrando múltiplos vírions YFV (ampliação original × 234.000). Imagem da Biblioteca de Imagens de Saúde Pública, Centros de Controle de Doenças. (B) O vírion infeccioso imaturo (intracelular) e maduro (extracelular). O genoma de RNA infeccioso de fita simples é empacotado em um nucleocapsideo icosaédrico com um envelope lipídico e proteínas viral spike prM/M e E. A proteína prM é processada para M por clivagem mediada por furina imediatamente antes da saída. (Cortesia dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças; com permissão.)

O genoma empacotado dentro do vírion YFV é uma molécula de RNA infecciosa de polaridade positiva e de fita simples, com aproximadamente 11 kb de comprimento11. Semelhante aos RNAs mensageiros do hospedeiro (mRNAs), o genoma possui uma estrutura cap no terminal 5', mas, ao contrário da maioria dos mRNAs do hospedeiro, carece de poliadenilação do terminal 3'. Em vez disso, os nucleotídeos do terminal 3 'formam uma estrutura muito estável e altamente conservada stem-loop structure haste-alça, servindo para estabilizar o genoma e fornecer sinais para o início da tradução e síntese de RNA. Todas as proteínas virais são codificadas em uma única estrutura de leitura aberta (ORF), produzida como uma poliproteína e processada por clivagem proteolítica. As proteínas estruturais (C, M e E) que formam o vírion são codificadas no primerio quarto 5′ do genoma, enquanto as proteínas não estruturais (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) que formam a replicase viral são codificadas nos três quartos restantes.

Os flavivirus 

Segundo Ribeiro (2014), os Flavivirus são vírus que pertencem a um gênero da família Flaviviridae, que englobam outros gêneros o Hepacivirus, Pegivirus e Pestevirus (ICTV, 2014). Apesar de suas particularidades, estes gêneros compartilham não apenas similaridades morfológicas, mas, também, estratégias de replicação e organização do genoma (LINDENBACH, et al. 2007). Os gêneros Hepacivirus e Pegivirus possuem distribuição global e estima-se que infecções por HCV e GBV-C contaminem de 2 a 5% da população mundial (STAPLETON et al. 2011, KOOPOR et al. 2013). Já os Pestivirus são causadores de diversas doenças em animais, entre eles, os vírus de Diarréia Bovina Viral (BVDV-1 e 2), Peste Suína Classíca (CSFV) e HoBi-like ou BVDV-3 considerado vírus emergente deste gurpo (THIEL et al. 2005; BAUERMANN et al. 2013). O gênero Flavivirus compreende mais de 60 vírus distribuidos mundialmente, dos quais, 43 são importantes agentes patogênicos humanos, gerando grandes impactos econômicos, sociais e de saúde pública (MURPHY et al. 1995, FERNADEZ-GARCIA et al. 2009). Além disso, permanecem como uma constante e crescente preocupação em relação a reemergências virais e surgimento de novos vírus. Neste contexto, destacam-se o vírus Zika considerado emergente na África e o vírus West Nile (WNV) nas Américas (TAPPE et al. 2014, HADLER et al. 2014)(Ribeiro, 2014).

Com base na epidemiologia, antigênica e critérios filogenéticos, os Flavivirus podem ser divididos em quatro grupos,
1) um possuem transmissão por vetores artrópodemosquitos,
2) um grupo por artrópode-carrapatos e
3) por vetores não conhecidos, além dos
4) flavivírus exclusivos de insetos (GOULD e GRITSUN, 2008).

O grupo de vírus transmitidos por artropodes é o maior e mais representativo causador de doença em humanos, também conhecida, como arboviroses. Os arbovírus são vírus transmitidos a hospedeiros vertebrados suscetíveis a artrópodes hematófagos infectados, podendo causar febres hemorrágicas, doença encefálica grave e doença febril, com considerável morbidade e mortalidade (SCARAMAZZINO et al. 2001; FIGUEIREDO, 2008).

No Brasil foram isolados onze flavivírus, entre eles os quatro sorotípos de Dengue, Bussuquara, Cacipacoré, Iguape, Ilhéus, Rocio, encefalite de Saint Louis (SLE) e Febre Amarela. Além destes, há evidências da circulação do WNV no país (Ribeiro, 2014)

Vetores/reservatórios e hospedeiros

O principal vetor e reservatório da FAS no Brasil e o mosquito do gênero Haemagogus janthinomys. Os hospedeiros naturais são os primatas não humanos (macacos). O homem não imunizado entra nesse ciclo acidentalmente. Na Febre Amarela Urbana, o mosquito Aedes aegypti L. é o principal vetor e reservatório e o homem, o único hospedeiro de importância epidemiológica.

Aedes aegypti (L. 1762) (1)
Aedes aegypti (L. 1762)
(Fonte: Muhammad Mahdi Karim)

Origem do nome Aedes aegypti L.
O vetor foi descrito cientificamente pela primeira vez, por Linnaeus em 1762, quando foi denominado Culex aegypti. Culex significa “mosquito” e aegypti, egípcio, portanto: mosquito egípcio. O gênero Aedes só foi descrito em 1818. Logo foi verificadp que a espécie Culex aegypti, descrita anos antes, apresentava características morfológicas e biológicas semelhantes às de espécies do gênero Aedes e não às do já conhecido gênero Culex. Então, numa revisão do gênero ficou estabelecido o nome Aedes aegypti. (Fiocruz).

Quantas pessoas um mosquito é capaz de infectar?
Os mosquitos fêmea sugam sangue para produzir ovos. 
Se o mosquito Aedes aegypti L. estiver infectivo, poderá transmitir o vírus da dengue neste processo. Em geral, mosquitos sugam sangue de uma só pessoa a cada lote de ovos que produzem. 

O mosquito Aedes sp. tem uma peculiaridade que se chama “discordância gonotrófica”, o que significa que é capaz de picar mais de uma pessoa para um mesmo lote de ovos que produz. Há relato de que um só mosquito da dengue infectivo transmitiu dengue para cinco pessoas de uma mesma família, no mesmo dia.

Aedes agypti (L.1762)
A fêmea do A. aegypti L. necessita de sangue para a produção de ovos. 
Como o macho dessa especie não produz ovos ele não necessita alimentar-se de sangue, alimentando-se de nectar e seiva de plantas. Todavia ha registros de que eles podem sim se alimentar de sangue. (Fonte: James Gathany 2,WP Domínio público).

Aedes aegypti (L. 1762) é o mosquito vetor do vírus da febre amarela (aedes: αηδής: odioso do egito). O mosquito Aedes aegypti é o principal vetor responsável pela transmissão do vírus da febre amarela (YFV) entre humanos. Conhecido como mosquito rajado, esse vetor é responsável por surtos explosivos de febre amarela urbana em cidades da África, América do Sul e América Central. (Fonte: Imagem da Biblioteca de Imagens de Saúde Pública, Centros de Controle de Doenças. Foto, James Gathany; contribuidor Frank Collins. (Cortesia dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças; com permissão).(europepmc)

Modo de transmissão
Na Febre Amarela Silvestre o ciclo de transmissão se processa entre o macaco infectado para o  mosquito silvestre e deste para um macaco sadio.

Na Febre Amarela Urbana a transmissão se faz através da picada do mosquito Aedes aegypti, em um humano infectado, para um mosquito Aedes aegypti  e deste para um ser humano sadio.

Período de incubação 
O período de incubação varia de 3 a 6 dias, apos a picada do mosquito infectado.

Período de transmissibilidade
O sangue dos doentes é infectante 24 a 48 horas antes do aparecimento dos sintomas até 3 a 5 dias após o término dos sintomas, tempo que corresponde ao período de viremia. No mosquito Aedes aegypti, o período de incubação é de 9 a dias, após o que se mantém infectado por toda a vida.

Diagnóstico
O diagnóstico é clínico, epidemiológico e laboratorial.

Diagnóstico Laboratorial
Específico
O Isolamento viral é realizado a partir de amostras de sangue, derivados ou tecidos coletados nos primeiros 5 dias após o início da febre. Reação em cadeia de polimerase (PCR); Imunofluorescência e Imunohistoquímica. 

Sorologia
Ensaio imunoenzimático para captura de anticorpos IgM (Mac-Elisa).
Na maioria dos casos requer somente uma amostra de soro sendo possível realizar o diagnóstico presuntivo de infecção recente ou ativa. Outras técnicas são utilizadas no diagnóstico sorológico, porém requerem sorologia com amostras pareadas tais como Inibição de Hemaglutinação (IH); Teste de Neutralização (N) e Fixação de Complemento(FC), considerando-se positivos os resultados que apresentam aumento dos títulos de anticorpos de, no mínimo, 4 vezes, entre a amostra colhida no início da fase aguda comparada com a da convalescença da enfermidade (intervalo entre as colheitas de 14 a 21 dias).

Inespecíficos
As formas leves e moderadas apresentam quadro clínico autolimitado, não há alterações laboratoriais importantes, salvo por leucopenia, discreta elevação das transaminases (nunca superior a duas vezes os valores normais encontrados) com discreta albuminúria caracterizada por encontro de cilindros hialinos no sedimento urinário. Nas formas graves clássicas ou fulminantes podem ser encontradas as seguintes alterações: leucopenia com neutrofilia.

Em pacientes com infecção secundária pode-se observar leucocitose com neutrofilia. Trombocitopenia (sendo comum valores de 50.000 plaquetas/cm³ ou valores menores) aumento dos tempos de protrombina, tromboplastina parcial e coagulação. Diminuição dos fatores de coagulação sintetizados pelo fígado (II, V, VII, IX e X). Aumento de: Transaminases (em geral acima de 1.000 UI); bilirrubinas (com predomínio da bilirrubina direta); colesterol; fosfatase alcalina; Gama-GT; uréia e creatinina, estas com valores (5 a 6 vezes ou até mais altos que os valores normais). Observe-se que a confiabilidade dos resultados dos testes laboratoriais dependem dos cuidados durante a coleta, manuseio, acondicionamento e transporte das amostras.

Diagnóstico diferencial
As formas leves e moderadas se confundem com outras viroses, por isso são de difícil diagnóstico, necessitando-se da história epidemiológica. As formas graves clássicas ou fulminantes devem ser diferenciadas das hepatites graves fulminantes, leptospirose, malária por Plasmodium falciparum, febre hemorrágica do dengue e septicemias.

Tratamento
Não existe tratamento antiviral específico. É apenas sintomático, com cuidadosa assistência ao paciente que, sob hospitalização, deve permanecer em repouso, com reposição de líquidos e das perdas sanguíneas, quando indicado. Os quadros clássicos e/ou fulminantes, exigem atendimento em Unidade de Terapia Intensiva, o que reduz as complicações e a letalidade.

Características epidemiológicas
A Febre Amarela Urbana não ocorre nas Américas desde 1954, sendo considerada erradicada dos centros urbanos. Com a reinfestação dos países americanos, inclusive o Brasil, com o Aedes aegypti, existe o risco da doença se reurbanizar, com repercussões sociais e econômicas imprevisíveis. 

No Brasil, anualmente ocorrem casos da FAS nas regiões Norte e Centro-Oeste, em áreas de mata onde existe a circulação do vírus amarílico. Embora o número de casos seja relativamente pequeno (máximo de 85 casos por ano, nos últimos quinze anos) a letalidade da doença é alta, variando entre 23 a 100% dependendo das intervenções feitas, como no caso de uma vigilância ativa. 

A zona endêmica da febre amarela. Os mapas representam as áreas na (A) África e (B) nas Américas que estão em risco de transmissão do vírus da febre amarela em 2009. (De Brunette GW, Kozarsky PE, Magill AJ, et al. CDC Health Information for International Travel 2010. Elsevier; 2009.)(Gardner and Ryman, 2010).
O vírus é endêmico em regiões tropicais da África e da América Latina, com uma população total de mais de 900 milhões de pessoas. Na América Tropical, além do Brasil, são relatados casos em oito países: na Colômbia, Peru, Bolívia, Venezuela, Equador, Paraguai, Argentina e ocasionalmente, na Guiana Francesa (WHO, 2013). Na África, onde ocorre maior disseminação, a Febre Amarela permanece endêmica em 34 países e é responsável por cerca de 90% de todos os casos notificados a Organização Mundial da Saúde (VASCONCELOS, 2002). Há uma estimativa de 200.000 casos de Febre Amarela por ano, causando 30.000 mortes, em todo o mundo. O número de casos da doença tem aumentado ao longo das últimas duas décadas, devido ao declínio da população imunizada, o desmatamento, a urbanização, a circulação da população e alterações climáticas (WHO, 2013, Ribeiro, 2014)

No Brasil estão definidas quatro áreas epidemiologicamente distintas
 
Área endêmica ou enzoótica
Regiões Norte, Centro Oeste e estado do Maranhão, onde o vírus se propaga continuamente através de grupos de macacos, propiciando o surgimento de casos em humanos.
 
Área epizoótica ou de transição 
Área onde ocasionalmente ocorrem epizootias de macacos, geralmente seguidas de casos humanos: abrange uma faixa que vai da região centro-sul do Piauí, oeste da Bahia, noroeste de Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul; 

Área indene (vulnerável)
Área onde não há evidências da circulação do vírus amarílico e abrange os estados da região nordeste, sudeste e sul; 

Área indene de risco potencial
São zonas de maior risco para circulação viral, contíguas e com ecossistemas semelhantes à área de transição, compreendendo os municípios do sul de Minas Gerais e da Bahia e a região centro-norte do Espírito Santo.


VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA


Objetivos
Reduzir a incidência de febre amarela de transmissão silvestre, impedir a transmissão urbana e detectar oportunamente a circulação viral para orientar as medidas de controle.
Notificação - Doença de notificação compulsória internacional, objeto de vigilância pela Organização Mundial da Saúde, de acordo com o Regulamento Sanitário Internacional, o que impõe a investigação epidemiológica de todos os casos.

Definição de caso
A) Caso suspeito 1 
Indivíduo com quadro febril agudo (até 7 dias), acompanhado de icterícia e/ou manifestações hemorrágicas, não vacinado contra febre amarela ou com estado vacinal ignorado.

B) Caso suspeito 2 
Indivíduo com quadro febril agudo (até 7 dias), residente ou que esteve em área com transmissão viral (ocorrência de casos humanos, epizootias ou de isolamento viral em mosquitos) nos últimos 15 dias, não vacinado contra febre amarela ou com estado vacinal ignorado.

C) Caso confirmado 
Todo caso suspeito que apresente pelo menos uma das seguintes condições: isolamento do vírus, MAC-ELISA positivo, laudo histopatológico compatível e com vínculo epidemiológico, elevação em quatro vezes ou mais nos títulos de anticorpos IgG através da técnica de IH (Inibição da Hemaglutinação), ou detecção de genoma viral; ou, todo indivíduo assintomático ou oligossintomático originado de busca ativa que não tenha sido vacinado e que apresente sorologia (MAC-ELISA) positiva para febre amarela.

D) Caso confirmado por critério clínico epidemiológico
Todo caso suspeito de febre amarela que evolui para óbito em menos de 10 dias, sem confirmação laboratorial, no início ou curso de surto ou epidemia, em que outros casos já tenham sido comprovados laboratorialmente.

E) Descartado 
Caso suspeito com diagnóstico laboratorial negativo, desde que se comprove que as amostras foram coletadas e transportadas adequadamente; ou, caso suspeito com diagnóstico confirmado de outra doença.

Vigilância
A ocorrência de casos humanos suspeitos e/ou confirmados, de epizootia ou a comprovação de circulação viral em vetores, são importantes para adoção das medidas de controle, portanto a notificação desses eventos deve ser imediata, pela via mais rápida.

De humanos
As medidas importantes são a vigilância das enfermidades que fazem diagnóstico diferencial com a febre amarela e a vigilância sanitária de portos, aeroportos e passagens de fronteira, com a exigência do certificado internacional de vacina, com pelo menos 10 anos da última dose aplicada para viajantes procedentes de países ou área endêmica de febre amarela.

De primatas não humanos 
Iniciar as medidas de controle a partir da observação de um macaco morto ou doente.

De vetores silvestres
A medida indicada é a captura destes mosquitos nas áreas de ocorrência de caso humano suspeito e/ou de epizootias, ou em locais de monitoramento da circulação viral, visando se proceder ao isolamento do vírus amarílico.

Yellow fever: human cases and case fatalities in Brazil 1930-2017. Source: Brazilian Ministry of Health, YF Epidemiological reports 1930-2018.


Propagação do vírus da febre amarela: rápido deslocamento para dentro e entre os biomas brasileiros. Linha tracejada preta: propagação viral do final de 1980 até 2010; linha branca: disseminação viral a partir da primeira metade da década de 2010, incluindo surto em curso no Sudeste. Fontes: IBGE/MMA 2004 para mapa dos biomas brasileiros. Ministério da Saúde do Brasil/Relatórios SVS, YF de 1999-2018 para informações epidemiológicas sobre ondas epizoóticas e casos humanos (A, Possas et alii, 2018).





O reservatório natural deste vírus são primatas não-humanos que habitam florestas tropicais, apresentando como vetor principal mosquitos da família Culicidae, (Dégallier, et al. 1992). Além dos mosquitos, foi demonstrado na África, o isolamento viral a partir de carrapatos Amblyoma variegatum, em áreas secas, o que pode indicar o papel secundário desses insetos na cadeia de transmissão dessa virose.  em que se demonstrou transmissão transovariana e para macacos

 Existem três tipos de ciclo de transmissão: silvestre, intermediário e urbano. Todos os três ciclos existentes na África. 

Já na América do Sul, apenas ocorrem o ciclo silvestre e urbano (Hanley, et al. 2013). No ciclo silvestre, várias espécies de mosquitos são responsáveis pela transmissão, sendo que no Brasil os gêneros Haemagogus e Sabethes são os principais vetores. O ciclo é mantido por primatas do gênero: Alouatta, Callithrix, Rhesus, Cebus, entre outros. O homem é infectado quando entra em contato com vetor de transmissão em áreas florestais ou periflorestais. (Ribeiro, 2014)

No ciclo urbano, o homem é o hospedeiro amplificador e a transmissão ocorre diretamente ao homem pela picada do mosquito Aedes aegypti L. 1762 (Araújo et al. 2010, Ribeiro, 2014).
No Brasil, a Febre Amarela urbana permanece erradicada desde 1942, quando foi registrada pela última vez, em Sena Madureira, no estado do Acre. No entanto, a febre amarela silvestre existe de forma endêmica e epidêmica e, em vários casos, muito deles fatais, são notificados anualmente (Batista et al. 2001). 

De 2000 a 2010 foram registrados 324 casos de Febre Amarela silvestre, totalizando uma letalidade de 47,8%, com picos de incidência nos anos 2003, 59 casos, e 2008 com dois surtos em populações não vacinadas, resultando em 21 casos confirmados, com nove mortes (letalidade, 43%) na região sul do estado do Rio Grande do Sul e 28 casos com 11 óbitos (39%) no estado de São Paulo (ROMANO, et al 2014, Ribeiro, 2014). 

O Ministério da Saúde continua recomendar a vacinação contra a febre amarela a cada 10 anos, em áreas consideradas de risco, embora seja dada prioridade à vacinação primária de pessoas não vacinadas anteriormente nestas áreas. Devido às notificações de epizootias, população não vacinada em áreas consideradas sem risco, casos de febre amarela silvestre, entre outros fatores, permanece o risco de reintrodução da doença no ciclo urbano (ROMANO, et al. 2014, Ribeiro, 2014). 


MEDIDAS DE CONTROLE

  1. A vacinação é a mais importante medida de controle. É administrada em dose única e confere proteção próxima a 100%. Deve ser realizada a partir dos nove meses de idade, com reforço a cada 10 anos, nas zonas endêmicas, de transição e de risco potencial, assim como para todas as pessoas que se deslocam para essas áreas. Em situações de surto ou epidemia, vacinar a partir dos seis meses de idade.
  2. Redução da população do Aedes aegypti, para diminuir o risco de reurbanização;
  3. Notificação imediata de casos humanos, epizootias e de achado do vírus em vetor silvestre;
  4. Vigilância de síndromes febris íctero-hemorrágicas;
  5. Desenvolver ações de educação em saúde e informar as populações das áreas de risco de transmissão.
REPLICAÇÃO VIRAL DO YFV 

O vírus da Febre Amarela possui o genoma constituído de RNA de fita simples, polaridade positiva, com aproximadamente 11 kilobases de comprimento e apresenta um cap na posição 5` e ausência de poli-A na posição 3’ (Figura 1). O vírion mede 25- 40nm de diâmetro e é circundado por envoltório de natureza lipoproteica. A partícula íntegra (vírion mais envelope) mede entre 40-50nm (MONATH, 2001). O genoma possui uma única fase aberta de leitura (ORF), flanqueadas por duas regiões não traduzidas (UTR) nas extremidades 5’ e 3’, contendo aproximadamente 100 4 e 500 nucleotídeos, respectivamente. Estas regiões possuem estruturas secundárias conservadas que dão origem a estruturas de stem-loop (SL), que conferem estabilidade ao genoma e promove a circularização dos terminais 5’ e 3’, fornecendo sinais importantes para a regulação e expressão das proteínas virais (MARKOFF, 2003; BOLLATI, et al. 2010). A região ORF do RNA viral expressa uma poliproteína que é processada por proteases virais e celulares, em três proteínas estruturais (prM, E e C) e sete não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (Rice et al., 1985).

Replicação em flavivíride

Representação do ciclo replicativo do flavivirus. 
Explicação da figura: 1) Partículas virais se ligam a receptores para proteína E; 2) O vírion penetra por endocitose mediada pelo receptor; 3) No endossomo ocorre rearranjo da proteína E; 4) Fusão do envelope lipídico com membrana endossomal; 5) Liberação do genoma; 6) Tradução imediata do genoma (é Cap-dependente, iniciada no 1° códon UAG); 7) Replicação do genoma viral (NS formam o complexo replicase e NS5 sintetiza cópias de RNA (-); 8) no RE, a proteína C se complexa com RNA genômico e são empacotados pela membrana do RE (heterodímeros de E e M); 9) Vírion imaturo vai ser transportado ao complexo de Golgi; 10) no complexo de Golgi ocorre clivagem de prM em M por furinas celulares, rearranjo da proteína E (maturação viral); 11) Os vírions maduros serão liberados por exocitose. 

Receptores celulares para o YFV
Sulfato de Heparana HS
O sulfato de heparana (HS) é um polissacarídeo linear encontrado em todos os tecidos animais. Ocorre como um proteoglicano (HSPG, i.e., Heparan Sulfate ProteoGlycan) no qual duas ou três cadeias de HS estão ligadas em estreita proximidade com a superfície celular ou proteínas da matriz extracelular. É nesta forma que o HS se liga a uma variedade de ligantes de proteína, e regula uma ampla gama de atividades biológicas, incluindo processos de desenvolvimento, angiogênese, coagulação do sangue, abolindo a atividade de descolamento por GrB (Granzyme B) e metástase tumoral. O HS também demonstrou servir como receptor celular para vários vírus, incluindo o vírus sincicial respiratório e YFV. Um estudo recente relata que o sulfato de heparano celular tem um papel na infecção por SARS-CoV-2, particularmente quando o vírus se liga ao ACE2.

Receptores e ligantes TAM
O nome da família TAM é derivado da primeira letra de seus três constituintes: Tyro3, ​​Axl e Mer (Prasad et al. 2006).
Os TAMs são amplamente expressos por células dos sistemas imunológico, nervoso, vascular e reprodutivo maduros. Os ligantes TAM (azul) são Gas6 e Protein S (Pros1). Os domínios SHBG do terminal carboxi dos ligantes se ligam aos domínios de imunoglobulina (Ig) dos receptores, induzem a dimerização e ativam as tirosina quinases TAM. Quando γ-carboxilado em uma reação dependente da vitamina K, os domínios Gla do terminal amino dos ligantes diméricos se ligam ao fosfolipídeo fosfatidilserina expresso na superfície de uma célula atrelada à célula apoptótica ou vírus envelopado. (De Lemke e Burstyn-Cohen 2010; adaptado, com permissão, dos autores.)

Receptor TAM (ncbi)

Receptores TIM (T-cell immunoglobulin and mucin domain: TIM)
Duas importantes familias de receptores PS: são T-cell immunoglobulin and mucin domain: TIM, e TYRO3-AXL-MERTK (TAM). Os membros TIM: TIM1, TIM3, e TIM4, e receptores TAM (TYRO3, AXL, e MRTK) foram identificados como fatores de entrada dos vírus DENV, WNV, e YFV (Meertens et al. 2012, Perera-Lecoin et al. 2-14).
Função dupla dos receptores TAM durante a infecção por flavivírus. Durante a entrada (endocitose), os receptores TAM capturam os complexos vírus-Gas6/ProS e aumentam a internalização do vírus por meio de mecanismos ainda desconhecidos. Em paralelo, os complexos vírus-Gas6/ProS ativam os receptores TAM, que recrutam o receptor do interferon (IFNAR) para induzir a expressão de SOCS1/3, inibindo assim as respostas antivirais inatas e facilitando a replicação dos flavivírus.

As partículas extracelulares de flavivírus (vírions) ligam-se às células-alvo pela interação com os receptores da superfície celular que ainda não foram identificados e são internalizadas por endocitose mediada por receptor. 

Um rearranjo conformacional da glicoproteína E ocorre no ambiente de pH mais baixo do endossomo, o que facilita a fusão do envelope lipídico viral com a membrana endossômica e a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma da célula. Após a desmontagem do nucleocapsídeo, a replicação prossegue com a tradução imediata do genoma. Duas repetições curtas e conservadas (CS1 e CS2) são encontradas 5' para a sequência de estrutura secundária putativa 3'. 

Foi postulado que o par de bases dessas sequências terminais circulariza o genoma para facilitar a tradução, replicação ou empacotamento do genoma.

Replicação do vírus da febre amarela em uma célula permissiva. O ciclo de replicação é descrito como uma série de etapas reguladas temporalmente: (1) Tradução da poliproteína; (2) processamento co e pós-tradução para produzir as proteínas estruturais (C, prM e E) e as proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5); (3) síntese de RNA complementar de sentido negativo pela RNA polimerase NS5 dependente de RNA e outros componentes da replicase viral; (4) síntese de genomas descendentes por transcrição da fita negativa; (5) os genomas da progênie são empacotados em nucleocapsídeos e germinam intracelularmente para adquirir o envelope.
 
A tradução dependente de cap da longa ORF  inicia em um códon AUG próximo à extremidade 5' do genoma, para o qual o vírus presumivelmente toma emprestado fatores de iniciação de tradução eucariótica do hospedeiro (eIFs), como componentes do complexo eIF4F, ribossomos ligados à membrana, e várias outras proteínas.(Gardner and Ryman, 2010

Digno de nota, os flavivírus também podem usar um novo mecanismo de tradução independente do cap em certas circunstâncias, talvez para competir melhor com a tradução de mRNAs do hospedeiro. O processamento co- e pós-tradução da poliproteína em proteínas maduras individuais envolve clivagens sequenciais fortemente reguladas, mediadas por proteases de origem tanto do hospedeiro quanto viral (ver fig. acima).(Gardner and Ryman, 2010)

As proteínas NS incluem as proteínas grandes e altamente conservadas NS1, NS3, NS5 e as 4 pequenas proteínas hidrofóbicas NS2A, NS2B, NS4A e NS4B. 

A glicoproteína NS1 é uma proteína incomum que parece ser parte integrante da virulência e da patogênese. Essa proteína pode ser associada a células, na superfície celular e extracelular, e desempenha um papel na patogênese por inibir a atividade da cascata do complemento. Por outro lado, os anticorpos NS1 específicos fornecem imunidade protetora por meio de mecanismos independentes e dependentes do receptor de Fc.(Gardner and Ryman, 2010

NS3 é uma enzima com importância central no ciclo de vida dos flavivírus. A serina protease N-terminal funciona com seu cofator essencial NS2B no processamento da poliproteína, enquanto a NTPase/helicase C-terminal realiza a separação da fita de RNA dependente de ATP durante a replicação.

A proteína NS5 tem 2 atividades enzimáticas distintas, separadas por uma região interdomínio: a S-adenosil metiltransferase está localizada no terminal N e é responsável por capear o RNA nascente, enquanto a RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) é responsável pela replicação do genoma do RNA viral é encontrada no C-terminal.(Gardner and Ryman, 2010)

Os polipeptídeos NS2A, NS2B, NS4A e NS4B consistem principalmente em vários domínios hidrofóbicos que abrangem a membrana. Acredita-se que essas proteínas associadas à membrana participem da montagem de complexos de replicação viral pela localização de NS3 e NS5 nas membranas por meio de interações proteína-proteína.(Gardner and Ryman, 2010)

As proteínas NS virais recém-traduzidas e processadas se associam para formar a replicase. A replicase reconhece a estrutura secundária no terminal 3' do RNA genômico e o NS5 RdRp (RNA-dependent RNA polymerase: RdRP) inicia a síntese de cópias de RNA de sentido negativo de comprimento total a partir do modelo do genoma (etapa 3 na figura). Esses RNAs de sentido negativo são rapidamente transcritos para produzir genomas de RNA de sentido positivo de descendência (etapa 4). A replicação do RNA é assimétrica com a síntese de fita positiva consideravelmente mais eficiente do que a síntese de fita negativa, provavelmente porque as diferentes estruturas de haste-alça presentes nas extremidades do terminal 3' das fitas positiva e negativa podem afetar a eficiência de iniciação de um complexo de replicação.

A replicação do flavivírus ocorre associada às membranas da célula hospedeira. A infecção causa proliferação dramática de invaginações esféricas conhecidas como pacotes de vesículas (vesicle packets) (VP) na região perinuclear do retículo endoplasmático (ER), pelo menos em parte por meio da atividade da proteína NS4A. A localização de várias proteínas NS virais e intermediários replicativos de dsRNA em VPs48,50 sugere que eles são o local de replicação viral. O sequestro da fábrica viral dentro dessas estruturas membranosas pode servir para concentrar os componentes virais e do hospedeiro e melhorar a eficiência da replicação, para ancorar o complexo de replicação viral e para ocultar os intermediários replicativos do RNA viral dos mecanismos de vigilância da célula hospedeira. A importância potencial dessa estratégia de evasão imunológica para a patogênese dos flavivírus ainda precisa ser elucidada. The potential importance of this immune evasion strategy to flavivirus pathogenesis remains to be elucidated.(Gardner and Ryman, 2010)

Dependendo da cepa do vírus e do tipo de célula, a síntese de RNA de YFV é detectável dentro de 3 a 6 horas após a infecção, e os vírions descendentes são liberados em cerca de 12 horas. Vírions imaturos não infecciosos se agrupam dentro do RER, onde o RNA viral se complexifica com a proteína C e é empacotado em uma bicamada lipídica derivada de RER contendo heterodímeros das proteínas prM e E, indicando que o brotamento através da membrana da célula hospedeira ocorre intracelularmente a partir da membrana de cisternas do RER. Pensa-se que o transporte subcelular de partículas imaturas de flavivírus para a superfície celular ocorre pela translocação de vesículas contendo vesículas imaturas dos componentes membranosos da célula para a membrana plasmática. A fusão dessas vesículas com a membrana plasmática, em seguida, libera o conteúdo da vesícula, incluindo vírions, para o ambiente extracelular. Durante a montagem e transporte de vírions imaturos, o precursor da proteína M (prM) protege as proteínas E de sofrerem alterações conformacionais irreversíveis em compartimentos ácidos da via secretora. 
A maturação dos vírions ocorre na rede trans-Golgi* por uma clivagem retardada mediada por furina da prM para M, desencadeando rearranjos na proteína E que promovem a infecciosidade. Partículas virais maduras e infecciosas são liberadas por exocitose no meio extracelular (etapa 5).(Gardner and Ryman, 2010).

* A maior parte das vesículas transportadoras que saem do retículo endoplasmático, são transportadas até o complexo de Golgi, onde são modificadas, ordenadas e enviadas na direção dos seus destinos finais. Ambas as faces estão associadas a compartimentos compostos de uma rede de estruturas tubulares e de cisternas: a rede cis de Golgi (CGN, Cis Golgi Network) e a rede trans de Golgi (TGN, Trans Golgi Network).





CODA
A história natural da febre amarela é a mesma da exploração do Novo Mundo, pois esta seguiu as rotas de exploração desde a África Central até à América (acredita-se que a doença foi trazida para a América através de ovos de mosquitos nos barris de água dos navios) e daí para a Europa. As primeiras epidemias ocorreram no México e em Cuba, em 1648. A doença chegou pela primeira vez ao Brasil no Recife, em 1685 e a Salvador, em 1692. Embora tenha tido origem em zonas silvestres tropicais, não se restringe a estas. Cidades setentrionais, como Nova Iorque, Filadélfia, Boston, Marselha e Londres já foram atingidas no passado por epidemias devastadoras, assim como a Espanha, Portugal e Itália. Em 1793, morreram 4.500 pessoas em Filadélfia e metade da população fugiu da cidade. Na construção do Canal do Panamá estima-se a morte de 22 mil trabalhadores, a maioria de febre amarela, dengue e cólera. No Brasil a febre amarela sempre esteve presente, inclusive no Rio de Janeiro, sendo endémica no começo do século, afastando navios e turistas (e por isso recebendo o epíteto de "túmulo dos estrangeiros", pois entre 1897 e 1906 matou 4 mil imigrantes). O médico brasileiro Oswaldo Cruz ficou famoso ao conseguir debelar a epidemia através do combate aos mosquitos. A febre amarela também foi a principal responsável pela espantosa mortalidade dos trabalhadores que construíram o caminho ferroviário Madeira-Mamoré. A doença confere imunidade duradoura sem o conhecimento de uma reinfecção. Na infecção natural os anticorpos aparecem durante a primeira semana da doença e permanecem por toda a vida. A imunidade passiva transitória, de mães imunes para os seus filhos, pode durar até 6 meses. A imunidade activa é obtida mediante a aplicação da vacina contra a febre amarela com duração de dez anos (uevora).


VÍRUS INFLUENZA

 O vírus e sua propagação 

 Fonte: Modificado de Google images


O vírus Influenza pertence à família Orthomyxoviridae, composta pelos três géneros: Influenza A, Influenza B e Influenza C.

Os tipos A e B são responsáveis pelas epidemias respiratórias que ocorrem quase todos os invernos e estão frequentemente associados com o aumento das taxas de hospitalização e de mortalidade. O tipo A, isolado pela primeira vez em 1933, infecta vários mamíferos (homem, cavalos, porcos e aves) enquanto o tipo B, isolado em 1940 infecta apenas o homem. O tipo C, isolado em 1947, não têm um impacto tão grande na saúde pública, pois não causa epidemias como os tipos A e B. Pode ser assimtomático ou produzir sintomas semelhantes à constipação comum.(Pedro e Costa, 2001)

Os vírus Influenza do tipo A podem ainda dividir-se em subtipos que se caracterizam pelas diferenças encontradas nas duas glicoproteínas, a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA), que fazem parte do envelope lipídico do vírus. Os subtipos correntes de tipo A são o A(H1N1) e o A(H3N2)

As partículas virais do vírus da gripe, ou vírions, possuem uma forma esférica ou ovóide, com aproximadamente 90-100 nm de diâmetro. A superfície exterior do virião encontra-se protegida por um envelope, bicamada lípidica que deriva da membrana plasmática da célula hospedeira durante o processo de “budding”. Neste envelope encontram-se inseridas as duas proteínas virais, a hemaglutinina (proteína trimérica responsável pela ligação do virião às células hospedeiras e pela fusão das membranas viral e celular) e a neuraminidase (importante na libertação do vírus após a sua síntese). Existem ainda outras proteínas com diferentes funções, como a proteína M1 (proteína de matriz e maior componente do virião) localizada na parte inferior do envelope e a proteína M2, que atravessa toda a espessura do envelope funcionando como canal iónico. (Pedro e Costa, 2001)

O genoma de RNA dos vírus de Influenza é constituído por oito segmentos (sete segmentos no caso de Influenza C). Cada um destes segmentos encontra-se fortemente associado a uma nucleoproteína formando uma nucleocápside helicoidal ou ribonucleoproteína (RNP). Por sua vez, cada RNP está associada a uma RNApolimerase constituída por três polipéptidos, o PB1, o PB2 e o PA. Cada segmento de RNA, do vírus Influenza, codifica uma ou mais proteínas diferentes.

O ciclo de vida do vírus influenza A. Os RNPs são representados por grampos de cabelo helicoidais, com as subunidades da polimerase (vermelho, marrom e verde) e NP (ciano) mostradas em cores diferentes. No núcleo, os processos de transcrição e replicação viral são representados de acordo com o modelo proposto por Jorba et al. A figura foi modificada de Das et al.











SARAMPO



CACHUMBA




HPV (HERPES PAPILIOMA VIRUS)
CATAPORA 
VARICELA

CHIKUNGUNYA
O arbovíirus Chikungunya (CHIKV) possui dois ciclos de transmissão distintos: ciclo enzoótico/silvático e urbano. No primeiro o vírus é transmitido por vários espécies de mosquito do gênero Aedes (A. furcifer, A. vittatus, A. fulgens, A. luteocephalus entre outros) a primatas não-humanos (macacos) especialmente na África, e o homem pode eventualmente se infectar quando entra em ambientes de florestas. O ciclo de transmissão urbano envolve duas espécies de mosquitos altamente antropofílicas A. aegypti e A. albopictus além do homem (o mesmo ocorre com a dengue).
O primeiro surto documentado causado pelo CHIKV foi em 1952-1953 na Tanzânia, causando doença febril acompanhada de severa artralgia (dor nas articulações). Após este, outros surtos pequenos têm ocorrido periodicamente na África e algumas epidemias na Índia e sudeste asiático. No entanto, epidemias explosivas de CHIKV foram recentemente observadas em diversas ilhas do oceano Indico com centenas de milhares de indivíduos infectados. O CHIKV causa uma doença febril geralmente com dor de cabeça, náusea, vômitos, mialgia (dor nos músculos), exantema (erupções avermelhadas na pele) e severa e persistente artralgia podendo durar meses ou anos. A maior parte dos sintomas pode ser confundida com dengue. Fazendo referência à postura contorcida assumida pelas pessoas infectadas por este vírus por causa das dores, o nome Chikungunya é derivado de uma palavra do idioma Makonde que significa “aqueles que se dobram”. Embora a taxa de mortalidade decorrente de infecções por CHIKV seja baixa, eventualmente podem atingir até 4,9%. É uma doença altamente incapacitante com sequelas que podem durar por anos mantendo o indivíiduo afastado de suas funções e gerando um importante impacto econômico.
Em 2010, foram diagnosticados os primeiros casos de infecção por CHIKV no Brasil em três pacientes que haviam viajado para a Indonésia e para a Índia. Embora ainda não existam relatos da circulação do vírus no Brasil, o risco de introdução é muito alto, principalmente devido em razão ao intenso fluxo de viagens internacionais, à competência, distribuição e alto índice de infestação do vetor (mosquitos Aedes albopictus e A. aegypti) e à alta viremia durante a fase aguda da doença em humanos. Adicionalmente, já há notificação de casos autóctones (quando a transmissão ocorre na região) na Guiana Francesa e outras regiões do Caribe.
Considerando-se o risco potencial de emergência desses vírus no Brasil e a inexistência de agentes antivirais específicos para tratamento, bem como a semelhança dos sintomas iniciais com uma série de outras infecções, especialmente a dengue, é fundamental que se tenham disponíveis testes diagnósticos rápidos, inequívocos e de baixo custo para o diagnóstico diferencial e o tratamento dos pacientes e as medidas de controle e vigilância epidemiologia recomendáveis.
O diagnóstico destas viroses utiliza geralmente ensaios de soro-neutralização ou isolamento viral que são laboriosos, demorados e dependem de amostras virais e instalações específicas. Com o intuito de possuirmos competência instalada para uma resposta rápida na eventualidade de um surto no país, o Laboratório de Virologia Molecular do Instituto Carlos Chagas/Fiocruz PR iniciou no ano de 2012 a produção de antígenos recombinantes do CHIKV como uma alternativa para o desenvolvimento de kits para o diagnóstico sorológico desta virose. Algumas proteínas recombinantes e anticorpos monoclonais já foram produzidos e estão em fase de caracterização/validação. Entretanto, a grande dificuldade de se obter um painel de amostras de soro de pacientes com infecção por CHIKV tem sido a grande limitação para validação e produção dos kits diagnósticos. Esses testes poderão contribuir para aumentar a habilidade de detectar e confirmar casos suspeitos, além de garantir uma maior independência tecnológica para o país. A rapidez no diagnóstico poderá ajudar a reduzir a mortalidade associada à CHIKV e ajudar no direcionamento de estratégias para controle da infecção durante um eventual surto dessas doenças.
Literatura relacionada sugerida:
Chikungunya virus infection: an overview. Caglioti C, Lalle E, Castilletti C,Carletti F, Capobianchi MR, Bordi L. New Microbiol. 2013, 36(3):211-27.
Present and future arboviral threats. Weaver SC, Reisen WK. Antiviral Res.2010 85(2):328-45.






CAXUMBA

O que é  a caxumba?
A caxumba é uma doença causada pelo paramyxovirus da classe rubulavirus, um tipo de vírus que acomete caracteristicamente as glândulas parótidas, que são as maiores das três glândulas salivares.
Grupo: Grupo V ((-)ssRNA)
Ordem: Mononegavirales
Família: Paramyxoviridae
Gênero: Paramyxovirus
Espécie: Mumps virus (MV) vírus da cachumba.
é um vírus ARN de cadeia simples de sentido negativo, do gênero Rubulavirus, esférico ou oval, com envoltura e com cerca de 200 nm de diâmetro. Ele contém uma cadeia linear com 15 mil nucleótidos de comprimento. Possui 12 subtipos: A, B, C, D, F, G, H, I, J, K, L e N.

O genoma do vírus da caxumba é envolto por proteínas N para formar um complexo de ribonucleoproteína helicoidal (RNP) flexível, vagamente enrolado, que consiste no genoma cercado por um nucleocapsídeo ao qual o RdRp está ligado. Os RNPs são circundados por um envelope, uma membrana lipídica, que contém dois tipos de spikes em sua superfície que correspondem às glicoproteínas HN e F. As proteínas M são encontradas no lado interno do envelope, conectando o envelope ao RNP. Os vírions variam em tamanho de 100 a 600 nanômetros (nm) de diâmetro e são pleomórficos em forma.


Sintomas
Os principais sintomas da doença são: febre, dor na face e aumento do volume das glândulas salivares. Ela também pode provocar dor no corpo e na cabeça. Complicações mais graves são raras, mas podem ocorrer, entre elas inflamação nos testículos (orquite), inflamação nos ovários (ooforite) em mulheres acima de 15 anos, inflamação do pâncreas (pancreatite) e inflamação que envolve cérebro e meninges (meningoencefalite).


Transmissão
A transmissão é principalmente aérea, por meio de gotículas de saliva do doente que possui o vírus. Na maior parte das vezes, a infecção se manifesta na infância.

É importante destacar que a pessoa com caxumba é capaz de transmitir o vírus cerca de uma semana antes de aparecerem os sintomas e até nove dias depois destas manifestações. Assim, sugere-se que o paciente fique longe do trabalho ou da escola, uma vez que existe a possibilidade de contaminar outras pessoas.

Diagnóstico e Tratamento
O diagnóstico é clínico e com auxílio de exame de sangue. Não há tratamento específico, o que se faz é aliviar os sintomas com anti-inflamatórios. São indicados repouso, o uso de medicamentos analgésicos e observação de possíveis complicações. No caso de inflamação nos testículos, o repouso e o uso de suspensório escrotal são fundamentais para o alívio da dor.

Prevenção
A prevenção é feita com o uso de vacina produzida com o vírus vivo atenuado da doença e faz parte do Calendário Básico de Vacinação. Em geral, está associada à época de vacinas contra sarampo e rubéola. As três juntas compõem a vacina tríplice viral. A primeira dose deve ser administrada aos doze meses e a segunda, entre quatro e seis anos.

​E atenção: mulheres que nunca tiveram caxumba, nem tomaram a vacina, devem procurar um posto para serem vacinadas antes de engravidar. Na gestação, a doença pode provocar aborto.

Deve-se ter em mente que existe a possibilidade de reinfecção quando a vacina perde a eficácia com o decorrer dos anos. Para uma pessoa que adquiriu caxumba, a recomendação é procurar um médico para diagnóstico e acompanhamento.


POLIOMIELITE

O que é a poliomielite?

A poliomielite é uma doença infecto-contagiosa viral aguda descrita desde a Antiguidade, porém reconhecida como problema de saúde pública, somente no final do século XIX, quando epidemias começaram a ser registradas em vários países do mundo. Sua etiologia infecciosa foi descoberta somente em 1908. É causada por três tipos de poliovírus (I, II e II) e manifesta-se em grande parte, por infecções inaparentes ou quadro febril inespecífico, em 90 a 95% dos casos. Nos quadros mais severos, a poliomielite pode manifestar-se com meningite asséptica, formas paralíticas e causar óbito.

As formas paralíticas representam cerca de 1 a 1,6% dos casos e possuem características típicas: paralisia flácida de início súbito, em geral nos membros inferiores, de forma assimétrica; diminuição ou abolição de reflexos profundos na área paralisada; sensibilidade conservada e arreflexia no segmento atingido e persistência de alguma paralisia residual após 60 dias do início da doença. A transmissão pode ocorrer de pessoa-a-pessoa, através de secreções nasofaríngeas, ou de objetos, alimentos e água, contaminados com fezes de doentes ou portadores. O período de incubação varia de 2 a 30 dias.

Demonstra-se a presença do Poliovírus nas secreções faríngeas e nas fezes, respectivamente 36 e 72 horas após a infecção, tanto nos casos clínicos quanto nas formas assintomáticas. O vírus persiste na garganta cerca de uma semana e, nas fezes, por 3 a 6 semanas. A suscetibilidade é geral, sendo que a infecção natural ou a vacinação conferem imunidade duradoura ao tipo específico de poliovírus.

Embora provavelmente os Poliovírus venham causando paralisia nos seres humanos há milhares de anos, a poliomielite só passou a ser considerada como um problema importante de saúde pública a partir do século XIX. Em 1953, antes da era vacinal, o coeficiente de incidência da poliomielite era superior a 20 por 100.000 pessoas nos Estados Unidos e a doença era de distribuição universal. (efdeportes)

Um grande avanço veio em 1948, quando um grupo de pesquisa liderado por John Enders no Children's Hospital Boston cultivou com sucesso o poliovírus em tecido humano no laboratório. Este grupo tinha recentemente cultivado caxumba com sucesso em cultura de células. Em março de 1948, Thomas H. Weller estava tentando cultivar o vírus da varicela em tecido pulmonar embrionário. Ele havia inoculado o número planejado de tubos quando percebeu que havia alguns tubos não utilizados. Ele, então usou uma amostra de cérebro de camundongo infectado com o vírus da poliomielite e a adicionou aos tubos de ensaio que estavam sobrando, na chance de o vírus crescer. As culturas de varicela não cresceram, mas as culturas de poliomielite tiveram sucesso. Esse desenvolvimento facilitou muito a pesquisa de vacinas e, em última análise, permitiu o desenvolvimento de vacinas contra a poliomielite. 

Enders e seus colegas, Thomas H. Weller e Frederick C. Robbins, foram reconhecidos em 1954 por seus trabalhos com um Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina. Outros avanços importantes que levaram ao desenvolvimento de vacinas contra poliomielite foram: a identificação de três sorotipos de poliovírus:  Poliovírus tipo 1, PV1, ou Mahoney e Poliovírus tipo 2: PV2 ou Lansing; e tipo 3,  PV3 ou Leon. A descoberta de que antes da paralisia, o vírus deve estar presente no sangue; e a demonstração de que a administração de anticorpos na forma de gamaglobulina protege contra a poliomielite paralítica.

A primeira vacina eficaz contra a poliomielite foi desenvolvida em 1952 por Jonas Salk e uma equipe da Universidade de Pittsburgh que incluía Julius Youngner, Byron Bennett, L. James Lewis e Lorraine Friedman, o que exigiu anos de testes. 

Salk foi à rádio CBS para relatar um teste bem-sucedido em um pequeno grupo de adultos e crianças em 26 de março de 1953; dois dias depois, os resultados foram publicados no JAMA. 

Leone N. Farrell inventou uma técnica de laboratório chave que permitiu a produção em massa da vacina por uma equipe que ela liderou em Toronto. A partir de 23 de fevereiro de 1954, a vacina foi testada na Arsenal Elementary School e no Watson Home for Children em Pittsburgh, Pensilvânia. 

A vacina de Salk foi então usada em um teste chamado Francis Field Trial, liderado por Thomas Francis, o maior experimento médico da história naquela época. O teste começou com cerca de 4.000 crianças na Franklin Sherman Elementary School em McLean, Virginia, e, eventualmente, envolveu 1,8 milhões de crianças, em 44 estados do Maine à Califórnia. Até a conclusão do estudo, cerca de 440.000 receberam uma ou mais injeções da vacina, cerca de 210.000 crianças receberam um placebo, consistindo de meios de cultura inofensivos e 1,2 milhão de crianças não receberam vacinação e serviram como um grupo de controle, que seria então observado para ver se algum contraiu poliomielite. 

Os resultados do teste de campo foram anunciados em 12 de abril de 1955 (décimo aniversário da morte do presidente Franklin D. Roosevelt, cuja doença paralítica era geralmente considerada causada pela poliomielite). A vacina Salk foi 60–70% eficaz contra PV1 (poliovírus tipo 1), mais de 90% eficaz contra PV2 e PV3 e 94% eficaz contra o desenvolvimento de poliomielite bulbar. 

Logo depois que a vacina de Salk foi licenciada em 1955, campanhas de vacinação infantil foram lançadas. Nos EUA, após uma campanha de imunização em massa promovida pela March of Dimes, o número anual de casos de pólio caiu de 35.000 em 1953 para 5.600 em 1957. Em 1961, apenas 161 casos foram registrados nos Estados Unidos. Uma semana antes do anúncio dos resultados do ensaio de campo Francis, em abril de 1955, Pierre Lépine, do Instituto Pasteur em Paris, também anunciou uma vacina eficaz contra a poliomielite.

Ao mesmo tempo em que Salk testava sua vacina, Albert Sabin e Hilary Koprowski continuaram trabalhando no desenvolvimento de uma vacina com vírus vivo. Durante uma reunião em Estocolmo para discutir vacinas contra a poliomielite em novembro de 1955, Sabin apresentou os resultados obtidos em um grupo de 80 voluntários, enquanto Koprowski lia um artigo detalhando as descobertas de um ensaio envolvendo 150 pessoas. Sabin e Koprowski eventualmente tiveram sucesso no desenvolvimento de vacinas. Por causa do compromisso com a vacina Salk na América, Sabin e Koprowski fizeram seus testes fora dos Estados Unidos, Sabin no México e na União Soviética, Koprowski no Congo e na Polônia. Em 1957, Sabin desenvolveu uma vacina trivalente contendo cepas atenuadas de todos os três tipos de poliovírus. Em 1959, dez milhões de crianças na União Soviética receberam a vacina oral Sabin. Por este trabalho, Sabin recebeu a medalha da Ordem da Amizade entre os Povos, descrita como a maior honra civil dos soviéticos, a vacina oral de Sabin usando vírus vivo entrou em uso comercial em 1961. Assim que a vacina oral de Sabin se tornou amplamente disponível, ela suplantou a vacina injetável de Salk, que havia sido manchada na opinião pública pelo incidente de Cutter em 1955, no qual as vacinas de Salk preparadas inadequadamente por uma empresa resultou na morte ou paralisia de várias crianças.





Vírus da Rubéola

A rubéola é uma doença aguda, de alta contagiosidade, que é transmitida pelo vírus do gênero Rubivirus, da família Togaviridae. A doença também é conhecida como “Sarampo Alemão”.

Transmissão

É causada por um vírus do gênero Rubivirus, o Rubella vírus. A rubéola é uma doença infecto-contagiosa que acomete principalmente crianças entre cinco e nove anos. A transmissão acontece de uma pessoa a outra, geralmente pela emissão de gotículas das secreções respiratórias dos doentes. É pouco freqüente a transmissão através do contato com objetos recém-contaminados por secreções de nariz, boca e garganta ou por sangue, urina ou fezes dos doentes. A rubéola congênita acontece quando a mulher grávida adquire rubéola e infecta o feto porque o vírus atravessa a placenta (bio).


A rubéola é uma doença exantemática aguda, de etiologia viral, que apresenta alta contagiosidade. 

A rubéola pós-natal geralmente tem apresentação benigna, muitas vezes é subclínica e tem baixa letalidade. A importância epidemiológica está representada pela possibilidade de ocorrência da síndrome da rubéola congênita (SRC) que atinge o feto ou o recém-nascido cujas mães se infectaram durante a gestação. A infecção na gravidez acarreta inúmeras complicações para a mãe (aborto, natimorto) e malformações congênitas na criança (surdez, problemas cardíacos, lesões oculares e outras).

A doença tem distribuição universal e a incidência de casos aumenta no final do inverno e no início da primavera.

Agente Etiológico

O vírus da rubéola pertence ao gênero Rubivírus, da família Togaviridae.

Reservatório

O único reservatório conhecido é o homem.


Modo de Transmissão

A rubéola pós-natal é transmitida, principalmente, por contato direto com indivíduos infectados pelas gotículas de secreções nasofaríngeas.

A transmissão indireta, pelo contato com objetos contaminados com secreções nasofaríngeas, sangue e urina, é pouco frequente.

A rubéola é transmitida, por via transplacentária, da mãe para o feto. A criança com rubéola congênita pode eliminar o vírus pela urina e secreções nasofaríngeas.

Período de Incubação

É de 12 a 23 dias, durando em média 17 dias.

Período de Transmissão

O indivíduo infectado pode transmitir a doença cerca de 5 dias antes até 5 a 7 dias após o aparecimento do exantema.

Crianças com rubéola congênita podem eliminar o vírus por período superior a 1 ano. A transmissão é maior nos primeiros meses de vida. Até os três meses de idade todas devem ser consideradas contagiantes2.

Suscetibilidade e Imunidade

A suscetibilidade é geral. A imunidade passiva é adquirida pelos anticorpos maternos e a imunidade ativa pela infecção natural ou por vacinação. Filhos de mães imunes, geralmente, permanecem protegidos pelos anticorpos maternos durante os primeiros 6 a 9 meses de vida. A imunidade ativa é duradoura e acredita-se que permaneça por toda a vida.

Manifestações Clínicas

De maneira geral não é observado período prodrômico na criança com rubéola. Adolescentes e adultos podem apresentar pródromos com febre baixa, cefaleia, dores generalizadas (artralgias e mialgias), conjuntivite, coriza e tosse.

A doença caracteriza-se por exantema maculopapular e puntiforme difuso, que se inicia na face, couro cabeludo e pescoço e se espalha, posteriormente, para todo corpo. A febre baixa e a presença de linfoadenopatia retroauricular, cervical e occipital - antecedendo, geralmente, por 5 a 10 dias o exantema - são sinais que colaboram para o diagnóstico diferencial frente a outras doenças exantemáticas. Cerca de 25% a 50% das infecções pelo vírus da rubéola são subclínicas2.

Diagnóstico Diferencial

O diagnóstico diferencial deve ser feito com outras doenças febris exantemáticas como sarampo, escarlatina, dengue, exantema súbito (crianças até 2 anos), eritema infeccioso, enteroviroses (coxsackie e echo) e, também, com outras doenças que podem causar síndromes congênitas, como mononucleose infecciosa, toxoplasmose e infecção por citomegalovírus.

Diagnóstico Laboratorial

Os exames laboratoriais - sorologia e/ou isolamento viral e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - são imprescindíveis para o estabelecimento do diagnóstico2,3. Os exames devem ser processados pelo Laboratório de Referência para a Eliminação do Sarampo, Rubéola/SRC que, no Estado de São Paulo (ESP), é o Instituto Adolfo Lutz (IAL).

O diagnóstico dos casos de rubéola é realizado mediante o isolamento viral positivo, a detecção de anticorpos IgM no sangue, na fase aguda da doença, desde os primeiros dias até 4 semanas após o aparecimento do exantema. Da mesma maneira a confirmação laboratorial se faz pela observação de aumento nos títulos de anticorpos específicos da classe IgG na fase de convalescência em relação a fase aguda (saude).

Técnicas de Diagnóstico Laboratorial

Para detecção de anticorpos podem ser utilizadas as seguintes técnicas:

• ensaio imunoenzimático (EIE/ELISA) para dosagem de IgM e IgG;
• inibição de hemoaglutinação (HI) para dosagem de anticorpos totais;
• imunofluorescência para dosagem de IgM e IgG;
• neutralização em placas.

Todos os testes têm sensibilidade e especificidade entre 85 a 98%.

O IAL, no ESP, e a Rede de Laboratórios de Saúde Pública de Referência para a Rubéola, nos demais estados do Brasil, utilizam somente a técnica de ELISA para detecção de IgM. O teste de ELISA é considerado mais sensível e específico do que o teste de imunofluorescência indireta.

Para dosagem de anticorpos IgG, precisa-se de duas amostras de soro: a primeira na fase aguda da doença e a segunda na fase convalescente.


Prevenção

A imunidade é adquirida pela infecção natural ou por vacinação, sendo duradoura após infecção natural e permanecendo por quase toda a vida após a vacinação. Filhos de mães imunes geralmente permanecem protegidos por anticorpos maternos em torno de seis a nove meses após o nascimento. Para diminuir a circulação do vírus da Rubéola, a vacinação é essencial. As crianças devem tomar duas doses da vacina combinada contra rubéola, sarampo e caxumba (tríplice viral): a primeira, com um ano de idade; a segunda dose, entre quatro e seis anos. Todos os adolescentes e adultos (homens e mulheres) também precisam tomar a vacina tríplice viral ou a vacina dupla viral (contra sarampo e rubéola), especialmente mulheres que não tiveram contato com a doença. Gestantes não podem ser vacinadas. As mulheres em idade fértil devem evitar a gestação por 30 dias após a vacinação. No caso de infecção, recomenda-se que a pessoa com rubéola (criança ou adulto) fique afastada de quem não contraiu a doença (bio).




RETROVÍRUS
HIV-AIDS

https://youtu.be/r8CBFEyODL8



https://youtu.be/SEYa0R62nWk




CLASSIFICAÇÃO DOS VÍRUS

Apesar de aparentemente não serem seres vivos (embora haja controvérsias), os vírus também são classificados de acordo com características e modos de interação com os seres vivos. 

A necessidade de classificar os vírus advém do fato de que eles infectam todos os outros organismos do planeta nos três domínios e em todos os reinos.  Um exemplo clássico são os vírus que agora são classificados na família Rhabdoviridae, que embora infectem hospedeiros de diferentes reinos, apresentam características comuns, devendo ser agrupados numa mesma categoria. 

No início da virologia (final do séx. XIX e inicio do séc. XX, os experimentos envolvendo vírus visavam a sua separação daqueles organismos que podiam ser visualizados no microscópio óptico e que podiam ser cultivados em meios de cultura. 

Devido a isto, os experimentos iniciais que envolveram a descoberta do vírus do mosaico do tabaco (TMV), o vírus da febre aftosa (Aphthovirus) e o vírus da febre amarela (Flavivírus) tinham uma única característica em comum: a habilidade de passar por filtros que retinham bactérias (filtros bacteriológicos).

Por razões  práticas, pelo menos, alguns virologistas concordam que os vírus devam ser considerados como um grupo separado de organismos, independentemente do hospedeiro que infectam, seja ele vegetal, animal, fungo, protoctista, arquéia ou bactéria.

A classificação inicial dos vírus foi feita por meio dos estudos que visavam a propriedade dos vírus de causar doenças e infecções. Logo, as primeiras classificações eram baseadas nas propriedades patogênicas comuns, tropismo celular do vírus, características ecológicas e de transmissão. 

Os vírus eram então classificados como dermotrópicos (causavam doenças de pele), respiratórios, entéricos (quando resfriados, gripes e diarreia), etc. 

Hoje, a taxonomia viral é supervisionada pelo International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) com regras e ferramentas exclusivas para a disciplina de virologia. 

O processo de taxonomia viral evoluiu, utilizando alguns dados de nomenclatura hierárquica da taxonomia tradicional, a identificação do vírus em espécies e reunindo-os em gêneros, gêneros dentro de famílias, e as famílias em ordens.

O Comitê Internacional de Nomenclatura dos Vírus (ICNV) foi criado em 1966, no Congresso Internacional de Microbiologia, que posteriormente em 1973 tornou-se o International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). (vfc)

Embora a nomenclatura dos táxons a partir de gênero seja padronizada (com o uso de sufixos próprios, como vírus para gênero, viridae para família, virales para ordem, etc.), a nomenclatura de espécies não segue nenhum padrão (sbv s/d).

Alguns nomes incorporam o nome do gênero no qual a espécie é classificada, mas isso não é aplicado de forma consistente. Alguns nomes de espécies se parecem com nomes de gênero (por exemplo, Lausannevirus). Alguns nomes de espécies são palavras únicas, alguns são binomiais e alguns são multinomiais. Alguns incluem letras e/ou números ou possuem elementos em latim (na maioria das vezes como um nome ou parte de um nome de um táxon hospedeiro).

Além disso, alguns têm sufixos idênticos em mais de um componente (por exemplo, Senegalvirus marseillevirus). Nesse contexto, a adoção de uma nomenclatura padronizada para espécies de vírus seria extremamente benéfica.

O Comitê Executivo recentemente propôs a adoção de um sistema binomial, preferencialmente baseado em latim, da mesma forma adotada na nomenclatura de espécies de organismos celulares (Siddell et al., 2020). O Comitê Executivo convidou a comunidade de virologistas a se manifestar a respeito (e obviamente houve manifestações passionais contra e a favor), e levará em conta esses comentários ao decidir se aprova um sistema binomial padronizado em sua próxima reunião, que deveria ocorrer em outubro de 2020. É importante ressaltar que esse sistema se aplicaria apenas aos nomes das espécies de vírus, e não aos nomes de vírus. De fato, um dos maiores benefícios da adoção desse sistema seria justamente permitir uma diferenciação clara entre os dois nomes (da espécie e do vírus), que atualmente são os mesmos na maioria dos casos (diferindo apenas na forma como são escritos).

Segundo Gorbalenya & Siddell (2021), As espécies são as unidades de evolução, e os levantamentos dos taxa correspondentes são usados ​​como um censo da abundância da biodiversidade natural (Ereshefsky, 1992). 

No entanto, a virologia é a única disciplina que ainda não abraçou totalmente este princípio básico da biologia. Acreditamos que isso se deva em grande parte a uma questão fundamental e não resolvida: até que ponto a taxonomia dos vírus iguala seus taxa de espécies com as entidades biológicas, também chamadas de espécies, que são estudadas no restante da biologia? 

As questões de definição, demarcação e significado das espécies na biologia são lendárias (de Queiroz, 2007; Mallo & Posada, 2016Gorbalenya & Siddell (2021)), mas as mesmas questões, que são igualmente relevantes para a virologia e a classificação dos vírus [13-19], não são amplamente discutidas entre os virologistas. Sustentamos isso porque o estudo de vírus no contexto de suas espécies não entrou na corrente principal da pesquisa de vírus.

Isso pode ser ilustrado por 2 exemplos. Primeiro, no GenBank, que é um ponto de entrada popular para todos os interessados ​​em informações biológicas (Gorbalenya & Siddell (2021)), as sequências do genoma de organismos celulares são especificadas usando o nome da respectiva espécie. 

Em contraste, as sequências do genoma dos vírus são normalmente especificadas no contexto de seus nomes de vírus. As espécies de vírus não são comumente definidas na hierarquia de taxonomia que o GenBank usa para descrever a posição dos vírus, embora todas as outras classificações taxonômicas sejam listadas. Na verdade, o delineamento das espécies de vírus no NCBI pode ser mais facilmente localizado em páginas exclusivamente dedicadas à taxonomia, enviando uma mensagem de que essa classificação é uma preocupação apenas para aqueles interessados ​​na taxonomia de vírus, e não para todos os virologistas (Peterson, 2014).

O segundo exemplo que apresentamos é a literatura relacionada à síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2), a causa da pandemia de doença coronavírus 2019 (COVID-19). 

Embora esse vírus tenha sido identificado apenas um ano atrás, a literatura que se acumula rapidamente já ultrapassa muitas dezenas de milhares de artigos: uma escala de atenção concedida a apenas alguns outros vírus. 

O vírus foi denominado SARS-CoV-2 devido à sua atribuição às espécies preexistentes Vírus relacionado à síndrome respiratória aguda grave pelo Coronaviridae Study Group (CSG) [24]. O título do artigo e seu resumo incluem o nome da espécie, e o lançamento público da pré-impressão no servidor bioRxiv e a subsequente publicação do artigo pela Nature Microbiology foram comentados por diversos meios de comunicação, incluindo Nature e Science

Na verdade, o nome SARS-CoV-2 foi amplamente aceito pela comunidade internacional. No entanto, os leitores da literatura SARS-CoV-2 terão dificuldade em encontrar algumas menções do táxon da espécie cognata deste vírus (vírus relacionado à síndrome respiratória aguda grave) nessas publicações, independentemente de o artigo CSG original ser ou não reconhecido.

Pode-se argumentar que todo mundo sabe onde o SARS-CoV-2 pertence, fazendo uma referência explícita à sua taxonomia hierárquica multiranques excessiva em trabalhos produzidos na época em que questões práticas de contenção da pandemia são a prioridade absoluta. 

Na verdade, muitos pesquisadores optaram por não se referir à taxonomia do coronavírus em suas publicações. No entanto, se qualquer menção à taxonomia for feita, a referência é tipicamente à família Coronaviridae, ao gênero Betacoronavirus ou ao subgênero Sarbecovirus. 

Essa disparidade é especialmente notável, uma vez que todos os taxa acima mencionados foram delineados e nomeados em momentos muito diferentes. Por exemplo, o subgênero Sarbecovirus cada vez mais popular foi reconhecido pela primeira vez apenas em 2018 [25], mais de uma década depois do que a espécie Severe Aguda Respirator Syndrome-related virus. Dado que as espécies de vírus representam mais de 70% de todos os táxons de vírus (Fig. 1), este exemplo revela uma desconexão entre o que os virologistas consideram ser as classificações mais informativas da taxonomia do vírus (ou seja, qualquer classificação diferente de espécie) e o que os taxonomistas pensam de como a pedra angular da taxonomia do vírus (a classificação das espécies). Essencialmente, significa que o desenvolvimento da virologia prossegue em grande parte sem o benefício do conceito de espécie, que está na base da biologia moderna.
Fig 1. As 15 categorias (rank) da taxonomia de vírus são mostradas como uma pirâmide invertida, e o número de táxons atualmente atribuídos a cada categoria (dezembro de 2020) é mostrado tanto numérica quanto graficamente.

Então, por que os virologistas não mencionam as espécies de vírus em seus trabalhos? Provavelmente, existem muitas razões, incluindo (1) uma relutância em aceitar os vírus como entidades biológicas (vivas?), apesar das extensas evidências em contrário; (2) um foco predominante de pesquisa de vírus e suas aplicações em vírus circulantes (frequentemente patogênicos) que são tipicamente um pequeno subconjunto do táxon da espécie, embora possam ser suficientemente divergentes para serem confundidos com uma “espécie”, tácita ou explicitamente; (3) uma tradição em virologia para citar táxons nas categorias de família e gênero, principalmente porque essas categorias foram estabelecidas primeiro [27]; e (4) a confusão persistente dos nomes dos táxons das espécies com os dos vírus que povoam esses táxons. Por exemplo, HIV-1 e HIV-2 podem ser facilmente confundidos com acrônimos das espécies Vírus da imunodeficiência humana 1 e Vírus da imunodeficiência humana 2, respectivamente. 

Isso está incorreto. As siglas referem-se aos vírus, vírus da imunodeficiência humana tipo 1 e vírus da imunodeficiência humana tipo 2, e não à espécie [5]. Uma oportunidade semelhante para confusão pode ser observada em muitos outros casos, por exemplo, vírus influenza A-D e, até recentemente, HCV, cuja espécie foi renomeada para Hepacivírus C para resolver este problema [28]. 

É de se esperar que a recente introdução de uma estrutura de classificação semelhante a Linneana de 15 categoria na taxonomia de vírus [29], e a introdução proposta de uma nomenclatura de espécie binomial para vírus [30], pode contribuir para melhorar a discriminação de nomes e espécies de vírus e nomes dos taxa de nível de espécie de uma maneira mais consistente e transparente. No entanto, essa mudança só terá um impacto real na virologia e além se os pesquisadores reconhecerem a importância das espécies de vírus e começarem a se referir a táxons de espécies (a taxa de nível espécie).
However, this change will only have a real impact in virology and beyond if researchers recognize the importance of virus species and start referring to species taxa.(Gorbalenya & Siddell, 2021)

O ICTV produz relatórios periodicamente contendo a classificação dos vírus. O último relatório foi publicado em 2006. Atualmente, os critérios mais importantes para a classificação dos vírus são: 
Hospedeiro, 
Morfologia da partícula viral e 
Tipo de ácido nucleico (DNA, RNA, fita simples, fita dupla...). 

Existem outros critérios usados para classificação como o 
Tamanho da partícula viral (vírion) 
Características físico-químicas do vírus 
Proteínas virais presente no capsídio e envelope, 
Sintomas da doença, 
Antigenicidade entre outros. 

Uma outra classificação não oficial, classifica os vírus em: 

Respiratórios 
Vírus que penetram no hospedeiro por inalação e produzem infecção e doença primariamente no trato respiratório. Ex: rinovírus, calicivírus, coronavírus. 

Entéricos 
Vírus que penetram pela via oral e replicam no trato intestinal. Ex: rotavírus. 

Arbovírus: Arthropods Borne Virus
São aqueles vírus que se replicam e são transmitidos por vetores artrópodes. Ex: vírus da encefalites eqüinas leste e oeste. 

Vírus oncogênicos
Vírus com potencial para induzir transformação celular e tumores nos hospedeiros. Ex: retrovírus, papilomavírus.

Classificação dos vírus em famílias, com base em algumas de suas propriedades

As características virais são consideradas para classificar os vírus em ordens, famílias e, em alguns casos, em subfamílias e gêneros.

Os vírus são normalmente agrupados em ordens, cuja nomenclatura tem a terminação, virales; famílias com terminação, viridae; subfamílias com a terminação, virinae; gênero, terminado em vírus e espécies, cuja nomenclatura é o nome do vírus em inglês. 

Nomenclatura de vírus e agentes subvirais é exceção no Código Internacional de Bionomenclatura (BIOCODE), não acompanhando as outras nomenclaturas biológicas. Desta maneira, a nomenclatura dos vírus não acompanha os termos binomiais em latim empregados para os organismos vivos. 

Os nomes de ordens, famílias, subfamílias, gêneros e espécies são escritos em itálico com a primeira letra maiúscula. Os nomes ainda não aprovados são apresentados entre aspas, em tipo comum. 

A classificação atual contém 4 áreas (realms), 9 reinos (kingdoms), 16 filos, 2 subfilos, 36 classes, 55 ordens, 8 subordens, 168 famílias, 103 subfamílias, 1421 gêneros, e 6590 espécies registrada no último relatório do ICTV em 2019 (Berlin) (ictv).

A taxonomia viral tem uma importante finalidade prática, uma vez que a identificação de um número limitado de características biológicas, tais como a morfologia do vírion, a estrutura do genoma ou as propriedades antigênicas, fornece um foco para a rápida identificação de um agente desconhecido para o clínico ou para o epidemiologista e pode ter um impacto significativo sobre a investigação suplementar de um tratamento ou prevenção das doenças virais.

Algumas dessas características que permitem classificar os vírus são:

Genoma, podem ser do tipo RNA ou DNA.
E na Classificação de David Baltimore (Prêmio Nobel de 1975) existem 3 grupos principais (vírus RNA, vírus DNA e vírus de Transcrição Reversa) dependendo de seu genoma e de seu modo de replicação do DNA.
Sua estrutura também apresenta diferenças.
Quanto aos seus hospedeiros: eles podem se hospedar em bactérias, plantas ou animais. Podem causar infecções em diferentes tipos celulares.

Por exemplo os Coronavírus são um grupo de vírus com algumas semelhanças que foram agrupados na família Coronaviridae. Todos são vírus de RNA, e podem se hospedar em diferentes animais e causar infecções no sistema respiratório.

Os primeiros coronavírus humanos foram isolados pela primeira vez em 1937. No entanto, foi em 1965 que o vírus foi descrito como coronavírus, em decorrência do perfil na microscopia ao microscópio eletrônico. O nome corona (coroa) vem das imagens da microscopia eletrônica uma vez que esses vírus possuem uma coroa (como a coroa do Sol) ao redor da partícula viral (vírion). Até maio de 2020, havia sete Coronavírus Humanos (HCoV) conhecidos de casos graves, entre eles o SARS-COV (que causa síndrome respiratória aguda grave), o MERS-COV (síndrome respiratória do Oriente Médio) e o SARS-CoV-2 (vírus que causa a doença COVID-19) (cienciaviva).

Uma das primeiras classificações desenvolvidas para os vírus foi a classificação proposta pelo virologista David Baltimore e publicada em 1971  em um artigo intitulado Expression of Animal Virus Genomes.

Inicialmente, continha os primeiros seis grupos, mas foi posteriormente expandida para incluir o grupo VII. Devido à utilidade da classificação de Baltimore, ela passou a ser usada junto com a taxonomia padrão para os vírus, que é baseada em relações evolutivas e governada pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV).

De 1990 a 2010, a taxonomia de vírus usou um sistema de 5 classificações que varia de ordem a espécie com a classificação de Baltimore usada em conjunto. Fora da estrutura oficial do ICTV, vários supergrupos de vírus unindo famílias e ordens diferentes foram criados ao longo do tempo com base em evidências crescentes de relações evolutivas mais profundas entre eles. Consequentemente, em 2016, o ICTV começou a considerar o estabelecimento de classificações acima da ordem, bem como a forma como os grupos de Baltimore seriam tratados entre os táxons mais elevados.

A Classificação de Baltimore é um sistema de classificação viral baseada na síntese viral de RNA mensageiro (mRNA) (Baltimore, 1971). O sistema agrupa os vírus em sete classes dependendo do seu genoma (DNA, RNA, cadeia dupla, cadeia simples), de sua replicação de DNA e se o sentido de um genoma de RNA de fita simples é positivo ou negativo.

A classificação de Baltimore também tem íntima correspondência com a maneira de replicação o genoma viral, portanto, a classificação de Baltimore é útil para agrupar vírus em critérios de transcrição e replicação.

Certos assuntos relativos a vírus estão associados a vários grupos específicos de Baltimore, como formas específicas de tradução de mRNA e a variedade de hospedeiros de diferentes tipos de vírus. Características estruturais, como a forma do capsídeo viral, que armazena o genoma viral, e a história evolutiva dos vírus não estão necessariamente relacionadas aos grupos de Baltimore.

A classificação de Baltimore tornou-se comum entre os virologistas e atualmente é usada em conjunto com a taxonomia de vírus padrão, que é baseada na história evolutiva. Em 2018 e 2019, a classificação de Baltimore foi parcialmente integrada à taxonomia do vírus com base na evidência de que certos grupos descendiam de ancestrais comuns. Vários reinos e filos agora correspondem a grupos específicos de Baltimore.

Resumindo a classificação de Baltimore é um sistema de classificação que coloca os vírus em um dos sete grupos, dependendo de uma combinação de seu ácido nucleico (DNA ou RNA), fita (fita simples ou fita dupla), sentido e método de replicação. Nomeados em homenagem a David Baltimore, um biólogo ganhador do Prêmio Nobel, esses grupos são designados por algarismos romanos e discriminam vírus dependendo de seu modo de replicação e tipo de genoma. Outras classificações são determinadas pela doença causada pelo vírus ou sua morfologia, nenhuma das quais é satisfatória devido a vírus diferentes causar a mesma doença ou serem muito semelhantes. Além disso, as estruturas virais são frequentemente difíceis de determinar ao microscópio (bio).






Bibliografia

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https://sbv.org.br/sbv/acoes-recentes-do-ictv-impactam-o-dia-a-dia-dos-virologistas/


Delimitação das espécies de vírus 
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https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (mostra os 4 realms, 9 kingdoms of virus)
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https://www.nature.com/articles/ismej201716 (cilco lisogênico na natureza)
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Primary Isolation Strain Determines Both Phage Type and Receptors Recognised by Campylobacter jejuni Bacteriophages
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Virologia da imunodeficiência humana





Comunicação entre bactérias e vírus


Para o blog


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VACINA 


https://www.google.com.br/amp/s/theconversation.com/amp/covid-19-vaccines-why-its-important-you-get-your-second-dose-161940

https://croplifebrasil.org/conceitos/crispr-a-surpreendente-tecnica-de-edicao-genetica/?gclid=Cj0KCQjww4OMBhCUARIsAILndv6bAVoMQbAQzTadyYj3s20hCySt_rrSZ7qkvlX4cZI-I54HVHpN5xkaAi0JEALw_wcB


Perera-Lecoin M, Meertens L, Carnec X, Amara A. Flavivirus entry receptors: an update. Viruses. 2013; 6(1):69-88. Pub. 2013 Dec 30. doi:10.3390/v6010069






Evolução de vírus RNA a partir da transcriptase reversa de um íntron bacteriano.
Os vírus de RNA podem ser considerados o único tipo de vírus que evoluiu em uma única ocasião a partir de uma fuga genética primitiva, em oposição aos vírus DNA que surgiram várias vezes. (wk)

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